论文部分内容阅读
米根霉脂肪酶具有高度的1、3位置专一性和立体选择性,在芳香酯、生物柴油、手性化合物等有机化合物的合成中具有很高的应用价值。利用基因工程技术实现米根霉脂肪酶的异源高效表达,对该酶的工业化生产具有重要意义。本文以米根霉菌株CICC3005为出发菌株,克隆了其脂肪酶基因,通过定点突变和全基因合成对该基因的密码子进行了优化,实现了其在毕赤酵母中的分泌表达,并对表达产物进行了初步的酶学性质研究。主要工作如下:(1)以总DNA基因组为模板,克隆了米根霉CICC3005脂肪酶基因前序列(prosequence)及成熟脂肪酶基因(pro-ROL及mature-ROL),并分别实现了其在巴斯德毕赤酵母GS115中的高效表达,其中pro-ROL最高酶活达到13.4 U/mL,mature-ROL最高酶活达到12.6 U/mL。表达产物经SDS-PAGE分析,表观分子量分别为35 kDa及30 kDa。对重组脂肪酶的酶学性质的初步研究表明,pro-ROL与m-ROL的最适温度均为30℃;pro-ROL的最适pH为8.0,m-ROL的最适pH为9.0;以对硝基苯酚脂为底物测得pro-ROL的最适底物为短链(C4),m-ROL的最适底物为中链(C10),推测重组脂肪酶分子量和酶学性质的差异可能是由于前序列对脂肪酶的折叠和修饰的影响而导致。(2)以米根霉成熟脂肪酶基因m-ROL为出发基因,结合毕赤酵母的密码子偏爱性,对其中的8个碱基进行了突变替换,优化了部分密码子,并将优化基因导入毕赤酵母GS115中进行了异源表达。初测酶活表明,优化基因的酶活高达15.5 U/mL,与出发基因相比提高了约30 %。证明密码子优化策略可以有效的提高目的蛋白的表达量,具有一定的借鉴意义。(3)以米根霉成熟脂肪酶基因m-ROL为出发基因,探索了通过二步法(组装PCR-酶连法)合成全基因,并成功获得m-ROL基因。测序结果表明,二步法合成全基因不仅简化了合成步骤,而且大大降低了PCR反应过程中易发生的碱基错配、突变等的影响,是一种高效的基因合成新策略。