北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性评价及GFP基因在病理学研究中的应用

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本研究利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析了北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性和遗传分化,建立了根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化体系,将外源gfp基因导入玉米丝轴黑粉菌并成功表达。获得的主要结果如下:1.筛选出26个扩增稳定、带纹清晰的RAPD引物,对从玉米丝黑穗病发生严重的大部分北方省市收集分离的68个玉米丝轴黑粉菌菌株进行了DNA遗传多样性分析,结果表明,RAPD谱带多态性为98.33%,北方玉米丝轴黑粉菌具有丰富的遗传多样性,遗传分化明显;种群内遗传变异小于种群间遗传变异。玉米丝轴黑粉菌遗传分化除明显受地理阻隔影响外,也可能与玉米种子调运过程中携带病菌基因的遗传迁移相关。2.利用NTSYS软件进行系统聚类分析表明,相似系数为0.76阀值时,68个菌株可划分为13个类群。研究结果完善和丰富了我国玉米丝轴黑粉菌遗传多样性评价研究,对玉米抗病资源筛选和抗病育种具有重要参考价值。3.构建带有报告基因gfp的重组双元质粒载体pCAMBIA0611,利用热击法导入根癌农杆菌,并成功实现了对玉米丝轴黑粉菌的转化。4.对不同的根癌农杆菌菌株、不同的玉米丝轴黑粉菌担孢子成熟度、不同的根癌农杆菌浓度等转化条件的比较研究,建立了根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化体系,结果表明根癌农杆菌GV3101介导,玉米丝轴黑粉菌担孢子在CM中培养3d,根癌农杆菌菌液OD600值为0.4左右时,转化效率最高,能达到280个转化子/106个细胞。5.将转化菌株与野生型菌株混合于PD液体中摇床培养,显微镜检发现两者能彼此结合,产生双核菌丝。说明外源基因的插入没有导致与交配结合相关的基因发生突变。6.利用注射法将结合的双核菌液接种于玉米自交系黄早四,二叶一心期PCR检测叶片表明转化菌株侵入到玉米叶片中,说明转化菌株对玉米具有一定的侵染力。成熟期田间能观察到发病植株,并有玉米丝轴黑粉菌冬孢子产生,表明转化菌株具有一定的致病性,侵染植株后能导致发病。7.田间发病植株雄穗小穗切片观察,能观察到玉米组织细胞间隙有明显的菌丝存在。荧光共聚焦显微镜观察,发现菌丝在玉米植株体内能产生绿色荧光。从而为跟踪菌丝的繁殖、扩展,研究抗病机理提供了新的研究手段。
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