拮抗放线菌W7的筛选、鉴定及次生代谢产物的研究

来源 :曲阜师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:shiguanghuai
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放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物,利用其产生抗生素制备的新型农药,具有无污染、无残留、可再生等特点,有效地避免了化学农药带来的诸多环境问题,是未来开发农药的方向。但就其数量、质量和品种而言,仍然不能满足生产发展的需求,因此寻找新型菌种已成为放线菌领域的研究重点。青海生态条件复杂而独特,决定了放线菌资源的独特性,为分离筛选新型菌种提供了可能。本研究从青海高原枸杞根际土壤中进行拮抗放线菌的分离、纯化,最终获得一株对多种细菌具有抑菌活性的放线菌,对其进行鉴定,并对其发酵条件、活性物质进行初步研究,主要研究结果如下:  1.共获得90株形态、颜色各异的菌株,采用琼脂块法与杯碟法相结合进行初筛和复筛,最终获得一株抑菌活性较好的菌株,将其命名为W7。该菌株对短小芽孢杆菌、产气杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、绿脓杆菌均具有抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最强,抑菌圈直径达到20mm以上,对真菌效果不明显。以青霉素为标准品,通过二剂量法测得该菌株发酵液的效价为2.452u/ml。  2.通过点滴法与叶片夹毒法发现菌株W7发酵产物对试虫具有较好的触杀活性和胃毒活性,且触杀活性好于胃毒活性。  3.综合形态学特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析对放线菌W7进行分类鉴定,将其初步鉴定为Streptomyces aurantiacus的一个变种。  4.通过单因素和正交试验相结合对菌株 W7的发酵培养条件进行优化,结果表明最优发酵工艺条件为:初始pH为8,装液量为75ml/300ml,发酵温度为28℃,接种量为4ml,转速为140-180r/min,发酵时间为168h。最优培养基为玉米粉2%,酵母粉0.6%,磷酸氢二钾0.075%,氯化钠0.025%,硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.002%。  5.对菌株W7发酵液中活性物质的稳定性进行了研究。经121℃高压处理20min后,发酵液的抑菌圈直径为16.8mm,经紫外照射6h后,发酵液的抑菌圈直径仍然达到17mm,在pH4~10的酸碱处理下,发酵液的抑菌活性无明显下降,但pH为2时,抑菌圈大小为15.7mm, pH为14时抑菌圈直径为12.6mm,经8周时间的室温保存,发酵液的活性没有出现明显下降。以上结果说明发酵液具有良好的酸碱、紫外照射、储藏及热稳定性,但在强酸强碱条件下不稳定。  6.采用有机溶剂对发酵液萃取发现,活性物质可以被正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取,且极性越强,有机相分配率越高,而石油醚、苯不能,该物质可能是一种中高度极性抗生素;pH层析结果显示随着pH的增大,活性物质的Rf值呈递减趋势,与酸性抗生素的层析图谱相符,说明该活性物质为酸性;发酵液粗提物经紫外全波段扫描在295nm处有最大吸收峰,薄层层析并生物显影后有一个椭圆的抑菌圈,说明该活性物质可能为单一成分。
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