盐胁迫下拟南芥胞内钙离子升高缺陷突变体的筛选及表型分析

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目前,全球盐碱土地面积约八亿公顷,占世界总土地面积的6%,同时由于灌溉施肥不当及工业污染等,全球盐渍化土壤面积呈现出持续增加的趋势。植物在盐渍土壤中会受到离子和渗透胁迫,阻碍对水和养分的吸收利用,抑制植物的生长发育。因此,固着生植物在漫长的进化过程中,产生了多种抵御高盐胁迫的机制,以保证盐胁迫下植物正常的生长发育。植物对外界盐胁迫的响应可以分为四个阶段:感知盐胁迫信号、传递信号、细胞响应与细胞适应。目前,有关植物盐胁迫相关的研究主要集中在上述后三个过程,而对植物如何将外界的盐胁迫信号转化为胞内化学信号的研究较少。现有研究表明,植物在受到盐胁迫时,胞内钙离子浓度在15秒内迅速增加,且不同环境胁迫刺激会诱导细胞产生不同形式的钙振荡,被称之为“钙离子表征”。细胞内下游组分接收到钙离子信号,并进一步通过调节相关基因的表达、蛋白活性等,减少盐胁迫对植物的损伤。然而,目前对于参与植物感知盐胁迫功能的基因研究非常匮乏,为了解决植物如何感知盐胁迫这一科学问题,我们通过正向遗传筛选的方法,探究植物细胞中特异感受外界盐胁迫刺激的元件。本论文以模式植物拟南芥为材料,利用水母发光蛋白(Aequorin,AQ)可特异结合钙离子,并将腔肠素氧化产生荧光的原理(胞内钙离子浓度增加时荧光较强,反之荧光较弱),结合植物整体成像系统,筛选了盐胁迫下拟南芥细胞内钙离子浓度升高缺陷的突变体。研究结果如下:1.通过EMS化学诱变,获得了表达Aequorin植株材料的EMS突变体库;利用植物整体成像系统挑选了NaCl处理后荧光较弱的植株作为候选突变体,共筛选了6000个T1代单株,其中荧光较弱的有1358个株系。2.上述1358个候选突变体株系经连续三代筛选后,最终获得三个表型遗传稳定的突变体株系,分别编号为81#、186#、1123#(即81/186/1123)。3.发现了81/186/1123突变体株系特异地在NaCl胁迫时胞内钙离子浓度升高产生缺陷,而其它非生物胁迫(5mM H2O2、600mM Sorbitol、4℃H2O、45℃H2O)均会诱导胞内钙离子浓度迅速上升。4.发现81/186/1123突变体株系对高浓度NaCl具有较强的耐受能力,突变体在含NaCl的MS培养基及含400mM NaCl土壤中死亡率显著低于野生型AQ株系。5.通过对81/186/1123突变体基因组DNA进行重测序,发现这三个突变体中均存在一个共同的SNP位点,并导致720基因转录提前终止。6.鉴定了81/186/1123突变体在各个时期是否存在生长发育上的表型(如:鲜重、叶面积、株高),结果发现突变体株系在各个阶段与野生型AQ均无显著差异。综上所述,我们筛选并获得了NaCl特异胁迫下,胞内钙离子浓度升高缺陷的拟南芥突变体,为揭示植物如何感知外界盐胁迫信号刺激,并将其转化为胞内信号,这一科学问题提供了新的研究材料和研究思路。
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