新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒（NDV）引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，是家禽的一种毁灭性疾病，给养禽业带来巨大灾难，被国际动物卫生组织列为A类烈性传染病。NDV为副黏病毒科(paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)中的一个成员。NDV基因组包含六个基因，分别编码六种结构蛋白，其基因组顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，在 NDV编码的各种蛋白中，NP蛋白是组成病毒核衣壳主要的、单一结构蛋白，在病毒的转录和复制中具有重要作用。　　 根据国内外已发表的NDV NP基因核苷酸序列设计并合成一对引物，定向引入BamHⅠ与HindⅢ双酶切位点，将F48E9 株NDV在SPF鸡胚上进行繁殖，收取病毒尿囊液，提取病毒RNA，经RT-PCR获得 NP基因序列，将NP基因与pMD18-T载体进行连接，转化到 E.coli DH5a感受态细胞中，挑取单个菌落进行培养，提取质粒，经过质粒PCR鉴定与双酶切鉴定并测序，获得阳性重组质粒将其命名为pMD18-T-NP，克隆的基因片段大小为1470bp，编码489个氨基酸。将pMD18-T-NP与pET32a(+)表达载体用BamHⅠ与HindⅢ进行相同的双酶切，回收纯化后将NP片段与pET 32a(+)载体片段进行连接，转化到 E.coli BL21感受态细胞中，挑取单个菌落进行摇菌培养，提取质粒，经过质粒PCR鉴定与酶切鉴定，获得阳性重组载体将其命名为pET32a-NP。将阳性菌用诱导剂IPTG进行诱导表达。诱导菌处理后进行 SDS-PAGE 和 Western blot试验，成功获得NP重组蛋白，重组蛋白约为71KU，大小与预期相符，具有很强的特异性。融合蛋白以包涵体形式出现，在诱导剂IPTG的浓度为1.0mM，诱导时间为4h表达量最大。通过Ni-NTA纯化，获得了重组的NP蛋白。　　 将收获的病毒尿囊液通过差速离心和密度梯度离心进行纯化。将纯化病毒和纯化的重组蛋白分别免疫BALB/C小鼠，加强免疫3天后进行细胞融合。采用间接ELISA方法进行筛选，有限稀释法进行亚克隆至获得稳定分泌抗 NDV NP 蛋白单克隆抗体的细胞株出现，最后获得3株阳性细胞株，命名为 3E7、2D11、4B12。经ELISA测定，腹水效价分别为5.12×105、6.4×104、5.12×105；经染色体计数鉴定，所得杂交瘤细胞染色体众数为86～100，说明细胞是脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体；经亚类鉴定单抗3E7、4B12为IgG1，单抗2D11为IgM；Western blot分析表明所获单抗是针对病毒NP蛋白，又结合间接免疫荧光(IFA)实验，证明这些单抗是针对F48E9 NDV NP蛋白天然结构的线性表位。在进行单抗与其他NDV毒株的反应试验中，单抗3E7、4B12与其它10株反应均呈阳性，单抗2D11仅与QY97、Mallard/CH/HLJ001/06、Mutkaswar反应呈阳性，而与其他毒株反应呈阴性。通过将NP蛋白分成短肽融合蛋白，对单抗识别抗原表位区进行初步分析，证明了2D11识别NP开放阅读框靠近C端的1303~1413处，共37个aa；融合蛋白大小约25KU左右；3E7、4B12识别NP开放阅读框靠C端的1372~1470处，共33个aa，融合蛋白大小约25KU左右。　　 这些McAb具有效价高、特异性强等特点，对单抗识别的抗原表位区的初步鉴定，为病原理论研究以及进一步建立高效、特异的ND诊断方法奠定基础。