论文部分内容阅读
肝硬化是严重危害人类健康的常见慢性病之一。肝纤维化是肝硬化的病理学基础，是多种病因(如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性肝病、药物及化学因素损伤等)引起肝脏损害和炎症，导致肝纤维化，最终发展为肝硬化的病理过程。肝纤维化是细胞外基质过度沉积的结果，也是进一步向肝硬化发展的主要中间环节。目前认为，肝纤维化是一个可逆的过程，而肝硬化是不可逆的，因此，抗纤维化治疗可阻止甚至逆转肝纤维化，防止肝硬化的发生，故一直受到高度重视。
肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)的活化和增殖是肝纤维化形成的中心环节。在病理情况下，HSCs被激活，失去原有的表型和功能，被激活的HSCs快速转化成为肌成纤维样细胞，肌成纤维细胞过度增殖，同时大量合成I、III型胶原等细胞外基质(ExtracellularMatrix，ECM)，最终导致肝纤维化。针对活化的HSCs的靶点治疗成为抗纤维化的重要的环节，因此抑制活化的HSCs细胞增殖和诱导活化的HSCs细胞凋亡是肝纤维化治疗的有效方法。
小檗碱(Berberine，Ber)又名黄连素，系从毛莨科黄连属植物黄连(CoptischinesisFeraneh)根和皮中提取的异喹啉类生物碱，为黄连的主要成分，临床主要用于肠道感染的治疗。随着近年来研究的深入，发现小檗碱具有广泛的药理作用，包括抗菌作用、抗炎作用、调节血脂作用、降糖作用、抗肿瘤作用等。已有研究表明，小檗碱可通过抗氧化和脂质过氧化作用抑制复合因素诱导(高脂、乙醇、CC14)的大鼠肝纤维化。通过对HepG2、H4IIE等多种肝癌细胞株的研究发现，小檗碱能够抑制这些细胞生长以及促进其凋亡。由此提示，小檗碱有可能通过抑制HSCs增殖或促进其凋亡，从而发挥抗肝纤维化作用。
本课题进一步研究证明了小檗碱具有抗肝纤维化的作用，同时深入探讨其作用的分子机制。
首先，我们检测了小檗碱对大鼠星状细胞系CFSC细胞的增殖作用的影响。结果显示，小檗碱抑制星状细胞的增殖，并呈现为时间和剂量依赖性。进一步用流式细胞术研究了小檗碱对CFSC的细胞周期进程的影响，发现小檗碱剂量依赖性的使CFSC细胞停滞在G1期，G2期细胞周期阻滞影响较小。研究其分子机制发现，小檗碱剂量依赖性地引起细胞周期抑制蛋白p21和p27蛋白和mRNA表达水平增高。
其次，我们研究小檗碱抑制星状细胞停滞在G1期，诱导p21和p27蛋白和mRNA表达水平增高的分子机制。转录因子Foxol可调控细胞周期蛋白依赖的激酶p21、p27的表达，其作用方式为去磷酸化的Foxol进入细胞核内，结合在下游靶基因的转录起始区域，调控下游基因的转录。我们通过CFSC细胞转染EGFP-Foxol实验发现，小檗碱可以影响Foxol蛋白的亚细胞定位，促进Foxol进入细胞核内，从而可能影响其转录活性。WesternBlot结果显示，加入小檗碱处理后，磷酸化Foxol(Set256)随时间增加而减少，验证了细胞转染实验中观察到的Foxol进入细胞核现象。我们进一步发现，小檗碱时间依赖性的减少Akt(Ser473)磷酸化，说明小檗碱可通过抑制Akt/PKB信号转导，从而抑制Foxol的磷酸化，促使Foxol进入细胞核内发挥转录活性。
同时，我们发现经过小檗碱处理的星状细胞，除了Foxol的磷酸化减少，总的Foxol蛋白表达也呈时间依赖性的增加。应用RealtimePCR发现，小檗碱可增加FoxolmRNA的表达，呈浓度梯度依赖性。应用放线菌素D抑制基因转录，作为基础值的未经处理的CFSC细胞中Foxol的半衰期为2.19±0.11h，而小檗碱预处理后的细胞中Foxol的半衰期延长至3.39±0.20h，较基础值延长了55％。通过这些实验结果可知，小檗碱可在转录后水平通过增加FoxolmRNA的稳定性来上调其表达，显示其调节Foxol活性的多样性。
最后，我们应用CC14诱导的小鼠肝纤维化模型，进一步在动物体内评价小檗碱抗肝纤维化的作用。造模组给予CC14处理后，血清ALT、AST显著升高，造模给予CC14处理同时给予小檗碱动物组血清ALT、AST则显著降低，且呈药物剂量梯度依赖性，表明小檗碱有减少化学性诱导的肝功能损伤的作用。肝脏标本HE染色观察，正常组小鼠肝小叶结构清晰完整，未见纤维组织异常增生；模型组肝小叶结构破坏，纤维组织大增生。与模型组相比，小檗碱中、低剂量组肝组织损伤、纤维组织增生程度较模型组轻。小檗碱高剂量组肝小叶结构基本正常，纤维组织异常增生不明显，明显减轻了肝纤维化程度。VanGieson胶原纤维染色显示，正常对照组肝脏胶原纤维只有少量见于汇管区和中央脉管壁，大血管周围；模型组胶原纤维广泛存在于纤维组织增生的汇管区、窦氏间隙，纤维间隔包绕形成假小叶；药物治疗组胶原纤维染色明显较模型组减少，纤维间隔染色较浅，无假小叶形成。a-SMA免疫组化染色显示，正常对照组小鼠肝脏a-SMA只表达于汇管区血管壁，在肝小叶内无表达。模型组a-SMA主要表达于汇管区及纤维间隔，且呈长椭圆形或梭形，阳性细胞呈绿色。荧光显微镜下观察，模型组a-SMA阳性细胞明显增多，数量高于正常组。小檗碱治疗组肝组织中a-SMA阳性蛋白表达见于汇管区的动、静脉壁，肝窦处散在表达，阳性表达面积明显低于模型组。Foxol免疫组化结果显示，正常组和CC14造模组未见明显Foxol阳性染色，给予小檗碱处理后，a-SMA阳性的细胞中，可见细胞核内Foxol阳性染色，表明小檗碱可诱导星状细胞的Foxol转位，使Foxol进入星状细胞核内，使分散在细胞质里Foxol聚集在细胞核里呈现阳性染色，在动物体内实验也进一步显示了小檗碱诱导Foxol核转位的作用。
综上所述，我们发现小檗碱可以有效地抑制肝星状细胞的增殖，不仅通过抑制Akt信号通路从而抑制Foxol的磷酸化，促使Foxol进入细胞核内，还可通过增加FoxolmRNA的稳定性来上调Foxol的表达，引起下游基因p21、p27基因表达增加，相应的蛋白水平表达增加，从而诱导肝星状细胞的细胞周期停滞在G1期，抑制肝星状细胞增殖。同时在体内实验，小檗碱对CC14诱导c57小鼠肝纤维化模型也有良好的抗肝纤维化作用。我们的实验结果提示，通过调节Foxol的活性可能为小檗碱抗肝纤维化作用的分子机制之一，调节Foxol活性可能是治疗肝纤维化的新策略之一。因此，开发调节Foxol活性的药物，可能是抗肝纤维化治疗的一条有用的途径。对小檗碱进行结构改造，保留或增强其抗肝纤维化的活性的同时增加其生物利用度，有可能开发出新的治疗肝纤维化的药物。