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目的:采用病证结合的方法,以冠心病痰证为研究对象,采集冠心病痰证黄腻苔、白腻苔患者及健康人舌苔及大便样本,运用冠心病痰证量表、舌诊仪客观化测量,研究冠心病痰证腻苔特异的微生物标志物及其与痰证证候的相关性。方法:1.腻苔微生物高通量测序:采用16S rDNA高通量测序技术,对冠心病痰证腻苔(黄腻苔、白腻苔)患者舌苔及其肠道微生物进行分析,并设立健康人作为对照组,研究冠心病痰证患者以及痰证黄腻苔与白腻苔之间的差异菌种属。2.冠心病痰证量表宏观测量:在入院后第1,4,7天,采用量表调查的方法,对冠心病痰证患者进行量表测量,评价其变化情况。3.典型腻苔客观化测量:采用舌诊仪采集冠心病痰证患者的舌象信息,包括舌质及舌苔颜色、舌苔面积、齿痕、瘀斑、裂纹及点刺。结果:1.一般情况:本研究共纳入合格研究对象41例,包括冠心病痰证白腻苔24例,黄腻苔17例,健康人对照组21例。痰浊证组中,男性27例,占65.8%,女性14例,占34.2%,平均年龄67.5(41-78)岁,病程36(1-620)个月,合并高血压30人,占73.2%,合并糖尿病5人,占12.2%,高脂血症9人,占22.0%。2.微生物高通量测序:(1)测序质量①舌苔样本质量评价:PE Reads(77292±6270),Raw Tags(68165±7893),Clean Tags(62086±8710),AvgLen(bp)(422±2),GC(%)(52.08±0.64),Q20(%)(95.86±0.48),Q30(%)(92.2±0.8),提示舌苔样本质量合格,可以进行下游分析。②大便样本质量评价:PE Reads(80284±5665),Raw Tags(73765±5349),Clean Tags(68206±5276),AvgLen(bp)(419±3),GC(%)(51.52±1.22),Q20(%)(96.28±1.02),Q30(%)(92.89±1.68),提示样本质量合格,可以进行下游分析。(2)OTU及物种分析①舌苔微生物OTU数量及物种分布:舌苔样本微生物OTU数为184±24个,总体分布在10± 1个门,16±2个纲,25±3个目,44±5个科,86±10个属。②舌苔优势微生物物种:病例组优势菌群:A.门水平为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria);B.纲水平主要为拟杆菌纲(Bacteroidia)、Bacilli、Gammaproteobacteria、Negativicutes、梭菌纲(Clostridia);C.目水平主要为 Bacteroidales、Lactobacillales、Selenomonadales、Betaproteobacteriales、Clostridiales;D.科水平主要为普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣菌科(Veillonellaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、疣微菌科(Ruminococcaceae);E.属水平主要为链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、韦荣菌属(Veillonella)、普雷沃氏菌属7(Prevotella7)、罗斯菌属(Rothia)。健康人对照组优势菌群:A.门水平为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria);B.纲水平主要为 Bacteroidia、Bacilli、Gammaproteobacteria、Negativicutes、梭菌纲(Clostridia);C.目水平主要为 Bacteroidales、Lactobacillales、Selenomonadales、Betaproteobacteriales、Fusobacteriales;D.科水平主要为普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣菌科(Veillonellaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae);E.属水平主要为链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、韦荣菌属(Veillonella)、普雷沃氏菌属7(Prevotella7)、梭杆菌属(Fusobacterium)。③肠道微生物OTU数量及物种分布:大便样本微生物总体的OTU数为156±37条,总体分布在9± 1个门、15±2个纲、23±5个目、41±9个科,91 ± 17个属。④肠道微生物优势物种:病例组优势菌群:A.门水平主要为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria);B.纲水平主要为拟杆菌纲(Bacteroidia)、梭菌纲(Clostridia)、Negativicutes、Gammaproteobacteria、Fusobacteriia;C.目水平主要为拟杆菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、Selenomonadales、Enterobacteriales、Betaproteobacteriales;D.科水平主要为拟杆菌科(Bacteroidaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Ruminococcaceae、韦荣菌科(Veillonellaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae);E.属水平主要为纤毛菌属(Leptotrichia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、普雷沃氏菌属 9(Prevotella9)、链球菌属(Streptococcus)。健康人对照组优势菌群:A.门水平主要为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门(Actinobacteria);B.纲水平主要为拟杆菌纲(Bacteroidia)、梭菌纲(Clostridia)、Negativicutes、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、放线菌纲(Actinobacteria);C.目水平主要为拟杆菌目(Bacteroidales)、梭菌目(Clostridiales)、Selenomonadales、Pasteurellales、Betaproteobacteriales;D.科水平主要为拟杆菌科(Bacteroidaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、韦荣菌科(Veillonellaceae)、疣微菌科(Ruminococcaceae);E.属水平主要为纤毛菌属(Leptotrichia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、韦荣菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)。(3)Alpha多样性比较①舌苔微生物多样性病例组的 Ace(203±28)、Chao(197±29)、Shannon(0.10±0.05)、Simpson(3.01 ±024)指数以及覆盖度(99.95± 0.01)。健康人对照组的 Ace(181 ±41)、Chao(177±43)、Shannon(0.13±0.07)、Simpson(2.81±0.44)指数以及覆盖度(99.96± 0.01)。病例组舌苔微生物Alpha多样性与健康人对照组比较,其Ace(p=0.10)、Chao(p=0.16)、Simpson(p=0.09)指数均升高,差异无统计学意义,Shannon指数降低(p=0.02),差异有统计学意义。②肠道微生物多样性病例组的 Ace(203±28)、Chao(197±29)、Shannon(0.10±0.05)、Simpson(3.01 ±0.24)指数以及覆盖度(99.95± 0.01)。健康人对照组的 Ace(181 ±41)、Chao(177±43)、Shannon(0.13±0.07)、Simpson(2.81±0.44)指数以及覆盖度(99.96±0.01)。病例组肠道微生物Alpha多样性与健康人对照组比较,其Ace(p=0.0007)、Chao(p=0.0013)、Simpson(p=0.009)指数均升高,Shannon 指数降低(p=0.03),差异有统计学意义。(4)Beta多样性①舌苔微生物病例组与健康人对照组之间舌苔微生物Beta多样性差异为12.5%(p=0.001);白腻苔组与黄腻苔组之间舌苔微生物Beta多样性差异为4.6%(p=0.432)。②肠道微生物病例组与健康人对照组之间肠道微生物Beta多样性为38.9%(p=0.001);白腻苔组与黄腻苔组之间肠道微生物Beta多样性为9.2%(p=0.210)。病例组与健康人对照组在舌苔和肠道微生物Beta多样性方面比较均有差异,白腻苔组与黄腻苔组在舌苔和肠道微生物Beta多样性方面比较也均有差异,且肠道微生物Beta多样性高于舌苔微生物。(5)物种丰度差异分析①舌苔微生物物种丰度差异分析:病例组与对照组相比,病例组在拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)(P-adj<0.0001)、弯曲杆菌属(Campylobacter)(P-adj=0.014)以及毛绒厌氧杆菌属(Lachnoanaerobaculum)菌属(P-adj=0.035)丰度下降,且差异显著。②肠道微生物物种丰度差异比较病例组与对照组相比,微生物丰度差异较多,在属水平,在链球菌属(Streptococcus)(P-adj=0.025)、奈瑟菌属(Neisseria)(P-adj=0.029)、韦荣菌属(Veillonella)(P-adj=0.020)、普雷沃氏菌属 7(Prevotella7)(P-adj=0.050)、放线菌属(Actinomyces)(P-adj=0.045)、颗粒链菌属(Granulicatella)(P-adj=0.004)、普雷沃氏菌属(Prevotella)(P-adj=0.040)、Solobacterium(P-adj=0.023)、Lachnoanaerobaculum(P-adj=0.046)、Oribacterium(P-adj=0.047)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)(P-adj=0.025)、弯曲杆菌属(Campylobacter)(P-adj=0.023)、Catonella(P-adj=0.009)、Bergeyella(P-adj=0.023)、Mogibacterium(P-adj=0.032)方面丰度较高,在拟杆菌属(Bacteroides)(P-adj=0.027)、Bilophila(P-adj=0.026)、Blautia(P-adj=0.023)、罗斯氏菌属(Roseburia)(P-adj=0.013)、毛螺菌属(Lachnospira)(P-adj=0.045)方面丰度较低。(6)功能预测①舌苔微生物KEGG功能分析:病例组与健康人对照组在KEGG方面功能分析比较有差异,具体为:A.classl水平,病例组在遗传信息处理(Genetic Information Processing)(P-adj=0.018)方面功能表达较低,在代谢(Metabolism)(P-adj=0.031)方面表达较强,且差异显著。B.class2水平,病例组在氨基酸代谢(Amino acid metabolism)(P-adj=0.005)等方面较高,在翻译(Translation)(P-adj=0.019),核酸代谢(Nucleotide metabolism)(P-adj=0.034),萜类化合物和聚酮化合物的代谢(Metabolism of terpenoids and polyketides)(P-adj<0.0001),复制与修复(Replication and repair)(P-adj=0.025),折叠、分选与降解(Folding,sorting and degradation)(P-adj=0.011),细菌感染(Infectious diseases:Viral)(P-adj=0.003),细胞生长与死亡(Cell growth and death)(P-adj=0.004)方面表达较低,且差异显著。②舌苔微生物COG分析:病例组与健康人对照组在COG方面功能分析比较有差异,具体为A.classl水平,病例组代谢(Metabolism)(P-adj=0.002)方面表达较高,差异有显著意义。B.class2水平,病例组在氨基酸转运与代谢(Amino acid transport and metabolism)(P-adj=0.037)方面表达较高,在转录后修饰、蛋白质周转以及伴侣(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)(P-adj=0.033),复制、重组与修复(Replication,recombination and repair)(P-adj=0.022),细胞壁/膜/包膜生物合成(Cell wall/membrane/envelope biogenesis)(P-adj=0.023)方面表达较低,且差异有统计学意义。③大便微生物KEGG分析病例组与对照组相比:A.classl水平,病例组在遗传信息处理(Genetic Information Processing)(P-adj=0.001)、人类疾病(Human Diseases)(P-adj<0.0001)方面表达较高,在有机系统(Organismal Systems)(P-adj=0.003)、细胞过程(Cellular Processes)(P-adj<0.0001)及代谢(Metabolism)(P-adj=0.001)方面表达较低。B.class2水平,病例组在翻译(Translation)(P-adj=0.031)、核苷酸代谢(Nucleotide metabolism)(P-adj=0.016)、膜运输(Membrane transport)(P-adj=0.043)、折叠,分类和降解(Folding,sorting and degradation)(P-adj=0.047)、神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)(P-adj=0.010)、其他氨基酸的代谢(Metabolism of other amino acids)(P-adj=0.001)、转录(Transcription)(P-adj=0.007)、内分泌和代谢疾病(Endocrine and metabolic diseases)(P-adj=0.001)、寄生虫病(Infectious diseases:Parasitic)(P-adj=0.005)方面表达较高,在免疫系统(Immune system)(P-adj=0.009)、环境适应(Environmental adaptation)(P-adj=0.001)、其他次级代谢产物的生物合成(Biosynthesis of other secondary metabolites)(P-adj<0.0001)、细胞运动(Cell motility)(P-adj<0.0001)方面表达较低。④大便微生物COG分析病例组与对照组相比,A.classl水平,病例组在细胞过程和信号(Cellular processes and signaling)(P-adj<0.0001)方面表达较高,差异有显著意义。B.class2水平,病例组在翻译,核糖体结构和生物发生(Translation,ribosomal structure and biogenesis)(P-adj=0.005)、翻译后修饰,蛋白质周转,伴侣蛋白(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)(P-adj=0.004)、核苷酸转运和代谢(N ucleotide transport and metabolism)(P-adj=0.008)、脂质运输和新陈代谢(Lipid transport and metabolism)(P-adj=0.006)、次生代谢产物的生物合成,转运和分解代谢(Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism)(P-adj=0.034)、RNA 加工和修饰(RNA processing and modification)(P-adj=0.002)、染色质结构和动力学(Chromatin structure and dynamics)(P-adj=0.006)以及细胞外结构(Extracellular structures)(P-adj=0.016)方面表达较高,在细胞运动(Cell motility)(P-adj=0.030)、防御机制(Defense mechanisms)(P-adj=0.003)、碳水化合物的运输和新陈代谢(Carbohydrate transport and metabolism)(P-adj=0.008)、信号转导机制(Signal transduction mechanisms)(P-adj=0.001)、转录(Transcription)(P-adj=0.008)方面表达较低,且差异有统计学意义。3.冠心病痰证量表宏观测量结果:(1)临床症状冠心病痰证患者的主要症状为胸闷、苔腻、脉滑、形体肥胖、疲乏、苔黄腻、苔白腻、口唇青紫、失眠、口干。寒化证与热化证组比较:其中胸闷、胸痛、苔腻、脉滑、形体肥胖是共有症状,热化苔黄腻组临床表现:苔黄、口干、口苦、舌质红是热化;寒化白腻苔组:疲乏、失眠、痰多、痞满是寒化证临床表现。(2)痰证量表测量得分冠心病痰证患者在胸闷、苔腻、脉滑三个条目的得分较高,在其他条目的得分较低。具体为:胸闷(2.01±0.5)、胸痛(0.54±0.74)、痰多(0.62±0.83)、身重(0.63±0.82)、痞满(0.48±0.74)、形体肥胖(0.9±0.88)、头重(0.44±0.77)、头晕(0.42±0.67)、舌质淡(0.67±0.95)、苔腻(1.89±0.49)、脉滑(1.47±0.77)、脉濡(0.07±0.26)、脉弦(0.74±0.95)、总分(10.89±2.94)。量表三次重复测量之间两两比较,结果提示冠心病痰证患者在胸闷(p<0.0001)、胸痛(p<0.0001)、痰多(p=0.026)、痞满(p<0.0001)、头晕(p<0.0001)、脉滑(p<0.0001)以及总分(p<0.0001)七项方面有差异,且差异有统计学意义。4.典型腻苔客观化测量:(1)冠心病痰证白腻苔组:舌象测量:①舌质R值(158±25)、舌质G值(116±19)、舌质B值(112±21);②舌苔R值(180±26)、舌苔G值(145±19)、舌苔B值(140±25);③舌苔面积比(0.38±0.22);④齿痕:齿痕数量1(0-4),齿痕面积0.57(0-8.06);⑤裂纹:裂纹数量1.5(0-8),最大裂纹长度 0.17(0-0.94)。(2)冠心病痰证黄腻苔组:舌象测量:①舌质R值(159±17)、舌质G值(108±]3)、舌质B值(99±16);②舌苔R值(188±13)、舌苔G值(141±11)、舌苔B值(126± 13);③舌苔面积比(0.28±0.15);④裂纹:裂纹数量2(0-7),最大裂纹长度0.17(0-0.92)。(3)健康对照组:舌象测量:①舌质R值(147±17)、舌质G值(119±16)、舌质B值(123±15);②舌苔R 值(169±17)、舌苔 G 值(153±14)、舌苔 B 值(158±16);③舌苔面积比(0.75±0.21)。病例组黄腻苔组与白腻苔组相比,提示黄腻苔组舌质B值(P<0.0001)、舌苔B值(P<0.0001)较低。病例组白腻苔组与对照组相比,提示冠心病痰证白腻苔组舌苔B值较低,最大齿痕面积较大,裂纹数较多,最大裂纹长度较长,点刺数较少。病例组黄腻苔组与对照组相比,提示冠心病痰证黄腻苔组在舌质B值较低,舌苔R值较高,舌苔B值、G值较低,裂纹数较多,最大裂纹长度较长,点刺数较少,最大点刺长度较短,最大点刺面积较小。结论:1.冠心病痰证舌苔微生物、肠道微生物在物种多样性、物种丰度方面与健康人对照组存在差异。2.舌苔物种差异分析和功能差异分析揭示:Streptococcus、Neisseria、Veillonella、Prevotella7、Actinomyces可能是冠心病痰证潜在的生物标志物。3.痰证量表宏观测量揭示:胸闷、苔腻、脉滑权重较高。4.舌象客观化测量提示:病例组舌质B值、舌苔B值、舌苔G值降低,为冠心病痰证诊断提供参考。