糖尿病患者中90%以上为2型糖尿病(T2DM),其主要的病理特征表现为,胰岛β细胞分泌胰岛素功能障碍,或/和靶器官对胰岛素的抵抗。近年来,T2DM炎症学说颇受关注,即T2DM是一种慢性低度炎症性疾病,持续的低度炎症反应贯穿于T2DM的发生与发展。低度炎症为机体的一种亚临床炎症,是感染性炎症和自身免疫性炎症水平以下的炎症,无临床上可见的红、肿、热、痛等局部或全身症状。在T2DM易感人群中,随着老龄化和营养过剩等因素的作用,先天性免疫系统被激活,巨噬细胞和脂肪细胞等细胞分泌多种炎症因子,进而引起或加重胰岛素抵抗(IR)。大量研究表明,从天然产物中提取的活性成分可通过不同途径增加胰岛素的敏感性,对于IR有一定的改善作用。本论文对课题组从补骨脂中分离鉴定的12个化合物(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂酚、异补骨脂色烯查尔酮、补骨脂查尔酮、4′,5′-去氢异补骨脂定、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂宁、补骨脂乙素、补骨脂定、次甘草查尔酮和新补骨脂异黄酮)开展活性筛选,发现异补骨脂色烯查尔酮(IB)可明显改善胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取。因此,本文对该化合物IB改善IR的作用及其作用机制开展研究。本文探索了IB改善胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取作用与机制。(1)建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。培养3T3-L1前脂肪细胞,用含有地塞米松、胰岛素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的诱导分化液将其分化为成熟的脂肪细胞,使用地塞米松建立胰岛素抵抗脂肪细胞模型,并设置空白对照组、模型组、阳性对照组、药物处理组。细胞处理后,收集细胞上清液,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测细胞培养上清液中葡萄糖含量。(2)使用Western blotting法研究IB对PI-3K/Akt胰岛素信号通路相关蛋白IRS-1、p-IRS-1、PI-3K、Akt、p-Akt,以及细胞膜蛋白GLUT4表达的影响。同时使用实时荧光定量PCR法检测GLUT4基因转录水平。(3)采用渥曼青霉素(PI-3K抑制剂)进一步检测IB对PI-3K/Akt信号通路的影响。同时,为了研究IB改善3T3-L1脂肪细胞炎症作用与机制,开展了以下工作。(1)使用RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型,研究IB对RAW264.7巨噬细胞炎症的影响。培养RAW264.7巨噬细胞,药物预处理1 h后,使用LPS建立炎症模型。设置空白对照组、模型组、药物处理组。收集上清,使用一氧化氮试剂盒、ELISA法检测IB对炎症细胞中NO、TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响。使用实时荧光定量PCR法测定炎症因子m RNA转录水平。Western blotting法检测IB对NF-κB和MAPK信号中关键蛋白表达水平的影响。免疫荧光实验观察IB作用后p65蛋白的核移位现象。(2)使用Transwell小室检测IB对巨噬细胞向脂肪细胞迁移能力的影响。使用ELISA法、实时荧光定量PCR法检测IB对炎症脂肪细胞产生趋化因子MCP-1、MCP-1α的影响。(3)建立脂肪细胞炎症模型,探索IB对脂肪细胞炎症的影响。使用上述方法将前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞后,采用TNF-α建立炎症脂肪细胞模型。设置空白对照组、模型组、药物处理组。细胞处理后,收集上清,使用ELISA法、实时荧光定量PCR法检测IB对炎症脂肪细胞分泌炎症因子的影响,以及使用Western blotting法研究IB对炎症主要信号通路JNK、NF-κB和SOCS-3相关蛋白的影响。结果显示,与模型组相比,IB可显著促进胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖摄取(P<0.001)。Western blotting分析结果表明,IB可增加PI-3K/Akt胰岛素信号传导通路关键蛋白(PI-3K、p-IRS-1和p-Akt)表达,促进GLUT4膜移位,即IB可通过激活PI-3K/Akt信号通路来调控葡萄糖转运,影响葡萄糖摄取,进而改善IR。炎症实验表明,IB可抑制RAW264.7巨噬细胞向IR脂肪细胞浸润,抑制RAW264.7巨噬细胞炎症因子分泌,及NF-κB和MAPK信号中关键蛋白(NF-κB/P65、ERK1/2、JNK和P38)磷酸化水平。同时,IB还显著抑制脂肪细胞炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β),趋化因子(MCP-1、MCP-1α)的分泌,以及炎症相关信号通路JNK、NF-κB和SOCS-3相关蛋白的表达。综上所述,IB可通过激活PI-3K/Akt信号通路改善IR脂肪细胞葡萄糖摄取,并通过可抑制JNK、NF-κB和SOCS-3炎症信号通路改善脂肪细胞炎症,进而起到改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的作用。