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随着我国老龄化程度日益加重,脑缺血的发病率逐渐升高,其高致残率、高致死率严重危害了人类的健康.因此,探讨脑缺血的发生机制并探讨其治疗措施已成为医学界亟待解决的重大难题.脑缺血预处理是一种内在的神经保护机制,它可以诱导脑组织对后续致死性脑缺血损伤产生耐受性,从而减轻缺血损伤.但脑缺血预处理诱导脑保护的机制尚未完全清楚.
谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质,它不仅参与了学习、认知、记忆等生理功能,还参与了包括脑缺血在内的多种神经系统疾病的病理过程.在脑缺血时,谷氨酸大量释放,导致细胞内钠钙浓度升高,进而引起线粒体功能障碍、蛋白酶激活、活性氧积累和一氧化氮释放,引发兴奋性神经毒性作用.谷氨酸的清除主要依赖于兴奋性氨基酸转运体2(Excitatory amino acid transporter 2,EAAT2),因其主要表达在星形胶质细胞,故又称胶质细胞谷氨酸转运体1(glia glutamate transporter-1, GLT-1).因此,设法调控GLT-1,上调其表达和/或功能,可能有利于脑缺血疾病的防治.
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要由细胞外调节蛋白激酶(extracellular-signal regulatedprotein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase, JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase,p38 MAPK)三条信号转导通路组成,在细胞增值、分化、凋亡中具有重要作用.p38MAPK是MAPK家族的重要成员,在脑缺血后调控神经元的存活中扮演着双重角色.有报道表明p38MAPK的激活会促进脑缺血后神经元的死亡.同时,越来越多的证据表明它的激活参与了缺血预处理(Ischemic preconditioning, IPC)诱导的神经保护作用.我室前期研究表明p38通过上调GLT-1参与脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受.最近有研究发现,SB203580可以提高癫痫大鼠脑组织中GLT-1的表达水平.本文旨在研究p38MAPK是否通过双向调节GLT-1参与脑缺血耐受和脑缺血损伤.
第一部分大鼠星形胶质细胞-神经元分层共培养体系及氧葡萄糖剥夺模型的建立
目的:
1确定大鼠星形胶质细胞与神经元分层共培养的天数;
2建立大鼠星形胶质细胞与神经元分层共培养的氧葡萄糖剥夺模型.
方法:
1观察星形胶质细胞与神经元分层共培养的天数对星形胶质细胞GLT-1表达的影响.取出生24h内新生鼠皮层进行神经元和星形胶质细胞的培养,随机分为6组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞单独培养,不与神经元进行共培养;
(2)共培养1d组:星形胶质细胞与神经元共培养1天;
(3)共培养2d组:星形胶质细胞与神经元共培养2天;
(4)共培养3d组:星形胶质细胞与神经元共培养3天;
(5)共培养4d组:星形胶质细胞与神经元共培养4天;
(6)共培养5d组:星形胶质细胞与神经元共培养5天.
上述各组在相应时间点收集细胞,Westernblot检测GLT-1蛋白的表达.
2确定OGD损伤的时间.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞与神经元不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧环境中培养;
(2)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,根据OGD时间不同,分别进行90min、120min、150min、180min、210min、240min的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
各实验组于OGD复氧后24h时间点收集细胞,Hoechst-PI染色法观察计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
3确定OGD预处理,即IPC的时间.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为4组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞与神经元共培养2天后,不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,分别进行30min、45min、60min的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(3)IPC+OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,先分别进行30min、45min、60min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中,24h后再进行4h的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(4)OGD4h:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4h的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
各实验组于末次OGD复氧后24h时间点收集细胞,Hoechst-PI染色法观察计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
结果:
1星形胶质细胞与神经元共培养可提高星形胶质细胞GLT-1的表达
Westernblot结果显示,与对照组相比,共培养1-5天的星形胶质细胞GLT-1表达均明显升高(P<0.05),其中从共培养2天开始GLT-1的表达趋于稳定.结果表明星形胶质细胞与神经元最适共培养天数为2天.
2不同时间的OGD可引起神经元不同程度的损伤
Hoechst-PI染色结果显示,对照组神经元胞核呈均匀蓝色荧光,形态规则,神经元死亡百分率为7.46±1.86%.与对照组相比,OGD各组引起了神经元不同程度的损伤(P<0.05),镜下可见胞核红色阳性率增加、染色质固缩.且随着OGD时间的延长,神经元的死亡率逐渐增加,OGD90min、120min、150min、210min、OGD240min分别为19.6±1.29%、29.18±1.64%、36±1.87%、47±1.92%、53.6±2.6%、59.97±3.26%.
MTS检测结果显示,与对照相比,OGD90min至240min均可显著降低神经元的活力(P<0.05),且随着OGD时间的延长,神经元活性越来越低.4hOGD可以使神经元活性降低到43.52±2.43%.
以上结果表明,星形胶质细胞-神经元分层共培养进行损伤性OGD的时间为4h.
3IPC可减轻由OGD引起的神经元损伤
Hoechst-PI染色结果显示,OGD30min、45min的神经元死亡率与对照组相比无显著性差异(P>0.05),OGD60min的神经元死亡率稍有增加,死亡率升高为11.76±1.74%(P<0.05).4hOGD神经元死亡百分率为59.97±3.26%.与4hOGD组相比,IPC+OGD各组均降低了神经元的死亡率(P<0.05),其中以45min+4hOGD保护作用尤为明显,神经元死亡率为42.12±1.34%.结果表明,45minOGD本身不影响神经元的存活,且对其产生了最大保护作用.
MTS检测结果显示,4hOGD可以使神经元活性降低到43.52±2.43%.与4hOGD组相比,IPC+OGD各组神经元活性明显增高(P<0.05).其中以45min+4hOGD神经元活性最高,为63.15±3.96%.OGD30min、45min的神经元活性与对照组相比无显著性差异(P>0.05);OGD60min与对照组相比神经元活性稍有下降(P<0.05),神经元活性降低为86.92±1.42%.
以上结果表明,45minOGD的保护作用最佳,接下来的实验中我们选择45minOGD作为OGD预处理的时间,即IPC.
小结:星形胶质细胞-神经元分层共培养的最适时间是2天;损伤性OGD的时间为4h;OGD预处理的时间为45min.
第二部分IPC是否通过激活星形胶质细胞p38MAPK调控GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤作用
目的:应用星形胶质细胞-神经元分层共培养技术,观察IPC对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响,探讨IPC是否通过激活星形胶质细胞p38MAPK调控GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤作用.
方法:
1观察IPC对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行IPC处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
于IPC后即刻、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h收集星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞GLT-1及p-p38MAPK的表达.于IPC后6h时间点收集星形胶质细胞,进行p-p38MAPK和GLT-1蛋白的免疫荧光双标检测.
2抑制p38MAPK对IPC后星形胶质细胞GLT-1表达的影响
2.1观察SB203580对IPC后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)SB+IPC组:IPC处理前30min给予SB203580处理,根据剂量不同,分为3个亚组,0.625μM、1.25μM和2.5μM,其余操作同IPC组(每个亚组n=3);
(3)DMSO+IPC组:IPC处理前30min给予SB203580处理,其余操作同IPC组.
上述各组于IPC后30min收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达.
2.2观察p38MAPKsiRNA对IPC后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)si-p38+IPC组:星形胶质细胞转染p38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理.根据siRNA剂量不同,分为3个亚组,1.25nM、2.5nM和2.5nM,其余操作同IPC组(每个亚组n=3);
(3)si-NC+IPC组:星形胶质细胞转染negativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理,其余操作同IPC组.
上述各组于IPC后30min收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达.
3抑制p38MAPK对IPC诱导的神经元保护的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为6组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行缺氧处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)IPC+OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,先进行45min的OGD,复氧24h后再进行4h的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(3)SB203580+IPC+OGD组:IPC处理前30min给予2.5μMSB203580处理,其余操作同IPC+OGD组;
(4)si-p38+IPC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMp38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理,其余操作同IPC+OGD组;
(5)DMSO+IPC+OGD组:IPC处理前30min给予DMSO处理,其余操作同IPC+OGD组;
(6)si-NC+IPC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMnegativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理,其余操作同IPC+OGD组.
各实验组于末次OGD复氧后24h收集细胞,Hoechst-PI染色法计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
结果:
1IPC可上调星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1的蛋白表达
Westernblot结果显示,对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白有一定量的基础表达.与对照组相比,p-p38MAPK从0min开始升高,并一直持续到6h(P<0.05),其中在30min时间点p-p38MAPK表达量最高,是对照组的5.58倍(P<0.05);随后p-p38MAPK的表达恢复到正常水平,12h、24h、48h时间点与对照组相比无显著差异(P>0.05).与对照组相比,GLT-1从30min开始显著升高,一直持续到48h,其中6h表达量达到高峰(P<0.05).
免疫荧光双标结果显示:对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1有一定量的基础表达,p-p38染色较浅,主要表达在胞核;GLT-1染色较浅,表达在胞膜.与对照组相比,IPC(6h)组p-p38MAPK在胞核的染色明显加深,表达增多(P<0.05).与对照组相比,IPC(6h)组GLT-1在胞膜染色明显加深,表达增多(P<0.05).
以上结果表明,IPC引起了星形胶质细胞p38MAPK的激活以及GLT-1表达的上调,且p38MAPK的激活早于GLT-1的上调.
2抑制p38MAPK可以剂量依赖性地下调p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达.
Westernblot结果显示,在30min时间点,与IPC组相比,SB203580+IPC组,随着SB203580(0.625μM、1.25μM、2.5μM)剂量的加大,IPC后p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达呈剂量依赖性地下调.DMSO+IPC组与IPC组相比,p-p38MAPK和GLT-1表达均无显著变化(P>0.05).
Westernblot结果显示,在30min时间点,与IPC组相比,si-p38+IPC组,随着p38MAPKsiRNA(1.25 nM、2.5 nM、5 nM)剂量的加大,IPC后p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达呈剂量依赖性地下调.si-NC+IPC组与IPC组相比,p-p38MAPK和GLT-1表达均无显著变化(P>0.05).
上述结果表明,SB203580或p38MAPKsiRNA均可以剂量依赖性地下调p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达.
3抑制p38MAPK可以阻断IPC诱导的神经保护作用
Hoechst-PI结果显示,IPC+OGD组神经元死亡率为42.12±1.95%.与IPC+OGD组相比,IPC前30min给予星形胶质细胞-神经元分层共培养体系2.5μM的SB203580,可使SB203580+IPC+OGD组神经元的死亡率增加到59.72±3.87%(P<0.05).与IPC+OGD组相比,给予星形胶质细胞5nM的p38MAPKsiRNA,2天后再与神经元进行共培养,可使si-p38+IPC+OGD组神经元的死亡率增加到58.9±2.82%(P<0.05).DMSO+OGD组和si-NC+OGD组与IPC+OGD组相比,神经元死亡率均无明显改变(P>0.05).
MTS结果显示,与control组相比,IPC+OGD组神经元活性为62.48±2.35%.与IPC+OGD组相比,IPC前30min给予星形胶质细胞-神经元分层共培养体系2.5μM的SB203580,可使SB203580+IPC+OGD组神经元的活性降低到44.34±1.33%(P<0.05).与IPC+OGD组相比,给予星形胶质细胞5nM的p38MAPKsiRNA,2天后再与神经元进行共培养,可使si-p38+IPC+OGD组神经元的活性降低到44.23±1.77%(P<0.05).DMSO+IPC+OGD组和si-NC+IPC+OGD组与IPC+OGD组相比,神经元活性均无明显变化(P>0.05).
上述结果表明,抑制p38MAPK可以阻断IPC诱导的神经保护作用.
小结:IPC通过适度激活星形胶质细胞p38MAPK上调GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤.
第三部分全脑缺血是否通过激活星形胶质细胞p38MAPK调控GLT-1表达介导脑缺血损伤
目的:
1观察全脑缺血对大鼠海马CA1区神经元存活以及p-p38MAPK和GLT-1表达的影响;
2应用星形胶质胞-神经元分层共培养技术,观察OGD对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响,探讨OGD是否通过激活p38MAPK调控GLT-1表达介导神经元损伤;
3抑制p38MAPK对全脑缺血后大鼠海马CA区神经元存活及GLT-1表达的影响.
方法:
1采用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型,观察全脑缺血对大鼠海马CA1区神经元存活以及p-p38MAPK和GLT-1表达的影响.选用健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为2组(n=15):
(1)sham组:不凝闭椎动脉,只暴露双侧颈总动脉;
(2)脑缺血(ischemia, IS)组:永久性凝闭椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流再灌注.
各组大鼠于假手术或全脑缺血手术后7d断头取脑,通过硫堇染色进行神经病理学评价;于6h、2d断头取海马脑组织,应用Westernblot法检测GLT-1和p-p38MAPK蛋白的表达(每个时间点n=5).
2采用星形胶质细胞-神经元分层共培养,观察OGD是否通过激活p38MAPK下调星型胶质细胞GLT-1表达介导神经元损伤
2.1观察OGD对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
于损伤性OGD后即刻、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h收集星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达;于损伤性OGD后6h、24h收集星形胶质细胞,进行p-p38MAPK和GLT-1蛋白的免疫荧光双标检测.
2.2观察SB203580和p38MAPKsiRNA对OGD后神经元存活的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为6组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(3)SB+OGD组:OGD处理前30min给予SB203580处理,根据剂量不同,分为3个亚组,0.625μM、1.25μM和2.5μM,其余操作同OGD组;
(4)si-p38+OGD组:星形胶质细胞转染p38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行OGD处理.根据siRNA剂量不同,分为3个亚组,1.25nM、2.5nM和5nM,其余操作同OGD组(每个亚组n=3);
(5)DMSO+OGD组:OGD处理前30min给予SB203580处理,其余操作同OGD组;
(6)si-NC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMnegativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行OGD处理,其余操作同OGD组.
各实验组于OGD复氧后24h时间点收集神经元,Hoechst-PI染色法计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
2.3抑制p38MAPK对OGD后星形胶质细胞GLT-1表达的影响
2.3.1观察SB203580对OGD后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)SB203580+OGD组:4hOGD处理前30min给予2.5μMSB203580处理,其余操作同OGD组;
(3)DMSO+OGD组:4hOGD处理前30min给予DMSO处理,其余操作同OGD组.
上述各组于OGD后6h、24h时间点收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达(每个时间点n=3).
2.3.2观察p38MAPKsiRNA对OGD后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)si-p38+OGD组:星形胶质细胞转染5nMp38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行4hOGD处理,其余操作同OGD组;
(3)si-NC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMnegativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行4hOGD处理,其余操作同OGD组.
上述各组于OGD后6h、24h时间点收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达.
3采用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型,观察SB203580对全脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元存活及GLT-1表达的影响
3.1观察SB203580对全脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元存活的影响.选用健康雄性Wistar大鼠25只,随机分为3组:
(1)IS组(n=5):永久性凝闭椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流再灌注;
(2)SB203580+IS(n=15)组:夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射SB203580,根据剂量不同,又分为3个亚组,0.625nmol、1.25nmol和2.5nmol,其余步骤同IS组;
(3)DMSO+IS组(n=5):夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射10μlDMSO,其余步骤同IS组.
各组大鼠于全脑缺血手术后7d断头取脑,通过硫堇染色进行神经病理学评价.
3.2观察SB203580对全脑缺血后大鼠海马CA1区GLT-1表达的影响.选用健康雄性Wistar大鼠15只,随机分为3组:
(1)IS组(n=5):永久性凝闭椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流再灌注;
(2)SB203580+IS组(n=5):夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射2.5nmolSB203580,其余步骤同IS组;
(3)DMSO+IS(n=5)组:夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射10μlDMSO,其余步骤同IS组.
各组大鼠于全脑缺血手术后6h、2d断头取海马脑组织,应用Westernblot法检测GLT-1蛋白的表达.
结果:
18min全脑缺血引起了海马CA1区锥体神经元的死亡、GLT-1表达减少及p-p38MAPK的表达增多
硫堇染色结果显示,sham组大鼠海马CA1区锥体神经元形态完整,胞核饱满,核仁清晰,神经元排列整齐,为2~3层,神经元密度(ND)值为207.2±6.99.IS组海马CA1区神经元大片死亡或缺失,并可见大量细胞碎片,与sham组相比,ND值显著下降,为27.4±3.56(P<0.05).实验结果表明,8min全脑缺血引起海马CA1区锥体神经元迟发性死亡.
Westernblot结果显示,sham组大鼠海马CA1区GLT-1有一定量的基础表达.sham(6h)组和sham(2d)组相比,GLT-1表达无明显差异(P>0.05).与sham(6h)组相比,IS(6h)组GLT-1表达明显下调(P<0.05).与sham(2d)组相比,IS(2d)组GLT-1明显下调(P<0.05).结果表明,8min全脑缺血引起海马CA1区GLT-1表达减少.
Westernblot结果显示,sham组大鼠海马CA1区p-p38MAPK有一定量的基础表达.sham(6h)组和sham(2d)组相比,p-p38MAPK表达无明显差异(P>0.05).与sham(6h)组相比,IS(6h)组p-p38MAPK显著上调(P<0.05).与sham(2d)组相比,IS(2d)组p-p38MAPK显著上调(P<0.05).结果表明,8min全脑缺血引起海马CA1区p-p38MAPK表达增多.
2OGD通过激活星形胶质细胞p38MAPK下调GLT-1介导神经元损伤
2.1OGD引起了星形胶质细胞p38MAPK的激活以及GLT-1表达的降低
Westernblot结果显示,对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白有一定量的基础表达.OGD组各个时间点p-p38MAPK的表达与对照组相比均明显升高(P<0.05),但以12h表达量最高,是对照组的12.45倍.与对照组相比,GLT-1蛋白在0min、15min、30min三个时间点有短暂的升高(P<0.05),从1h开始降低,随着时间的推移逐渐降低,在6h、12h、24h和48时间点均明显下调(P<0.05).
免疫荧光双标结果显示,对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1有一定量的基础表达,p-p38染色较浅,主要表达在胞核;GLT-1染色较浅,表达在胞膜.与对照组相比,p-p38MAPK在6h和24h时间点在胞核的染色显著加深,表达增多(P<0.05);而GLT-1在6h和24h在胞膜的着色明显变浅,表达减少(P<0.05).
以上结果表明,OGD引起了星形胶质细胞p38MAPK的激活以及GLT-1表达的降低.
2.2抑制p38MAPK剂量依赖性地减轻OGD导致的神经元损伤
Hoechst-PI染色结果显示,与OGD组相比,提前给予SB203580或p38MAPKsiRNA可以剂量依赖地降低神经元的死亡率(P<0.05),2.5μM的SB203580和5nM的siRNA疗效最好,可以使神经元的死亡率降低到43.06±2.29%和42.56±3.83%.DMSO+OGD组和si-NC+OGD组与OGD组相比,神经元死亡率无明显差异(P>0.05).
MTS结果显示:与OGD组相比,提前给予SB203580或p38MAPKsiRNA可以剂量依赖地增加神经元的活性,2.5μM的SB203580和5nM的siRNA疗效最好,可以使神经元的活性增加到63.79±1.51%和62.20±4.00%(P<0.05).DMSO+OGD组和si-NC+OGD组与OGD组相比,神经元活性无明显差异(P>0.05).
Hoechst-PI染色结合MTS检测的结果表明,应用SB203580或p38MAPKsiRNA抑制p38MAPK可剂量依赖性地减轻OGD导致的神经元损伤,其中,2.5μM的SB203580和5nM的siRNA的保护效果最好.
2.3抑制p38MAPK能够逆转OGD引起的星形胶质细胞GLT-1表达下调
Westernblot结果显示,与OGD组相比,提前给予2.5μM的SB203580或5nMp38MAPKsiRNA可以上调损伤性OGD后星形胶质细胞GLT-1的表达(P<0.05).DMSO或NegativesiRNA对GLT-1的表达无明显影响(P>0.05).
结果表明,应用SB203580或p38MAPKsiRNA抑制p38MAPK可逆转由OGD引起的GLT-1表达下调.
3SB203580剂量依赖性地减轻全脑缺血后大鼠海马CA1区神经元的损伤,并且逆转由全脑缺血引起的海马CA1区GLT-1表达下调
3.1SB203580剂量依赖性地减轻全脑缺血后大鼠海马CA1区神经元的损伤
硫堇染色结果显示,IS组海马CA1区可见神经元大片死亡或缺失,ND值为27.4±3.56.SB203580+IS组中,随着SB203580剂量的增大可见海马CA1区锥体神经元损伤减轻:0.625nmol组与IS组相比ND值无明显差异(P>0.05);1.25nmol组可见CA1区神经元数量有所增加,细胞排列较松散,与IS组相比,ND值明显升高为132.2±5.21(P<0.05);2.5nmol组CA1区神经元状态明显改善,细胞形态较完整,排列较整齐,与IS组相比,ND值显著升高为165.0±6.0(P<0.05).
3.2SB203580逆转由全脑缺血引起的海马CA1区GLT-1表达下调
Westernblot结果显示,在6h时间点,与IS组相比,提前30min经侧脑室注射2.5nmol的SB203580可显著上调全脑缺血后GLT-1表达(P<0.05);在2d时间点,与IS组相比,SB203580(2.5nmol)+IS组GLT-1表达明显升高(P<0.05).在6h和2d时间点,DMSO+IS组与IS组相比,GLT-1的表达均无明显变化(P>0.05).
上述结果表明,SB203580可以剂量依赖性地减轻全脑缺血后海马CA1区神经元的损伤以及逆转由全脑缺血引起的海马CA1区GLT-1表达下调.
小结:全脑缺血通过过度激活p38MAPK下调GLT-1表达介导脑缺血损伤.
结论:
(1)星形胶质细胞与神经元共培养的最适时间是2天;星形胶质细胞-神经元OGD损伤的时间为4h;星形胶质细胞-神经元OGD预处理的时间为45min.
(2)IPC通过适度激活星形胶质细胞p38MAPK上调GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤作用.
(3)全脑缺血通过过度激活p38MAPK下调GLT-1表达介导脑缺血损伤.
上述结果表明,p38MAPK的激活犹如一把双刃剑,IPC通过适度激活p38MAPK上调GLT-1参与IPC诱导的神经保护作用;全脑缺血通过过度激活p38MAPK下调GLT-1的表达介导脑缺血损伤.
谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质,它不仅参与了学习、认知、记忆等生理功能,还参与了包括脑缺血在内的多种神经系统疾病的病理过程.在脑缺血时,谷氨酸大量释放,导致细胞内钠钙浓度升高,进而引起线粒体功能障碍、蛋白酶激活、活性氧积累和一氧化氮释放,引发兴奋性神经毒性作用.谷氨酸的清除主要依赖于兴奋性氨基酸转运体2(Excitatory amino acid transporter 2,EAAT2),因其主要表达在星形胶质细胞,故又称胶质细胞谷氨酸转运体1(glia glutamate transporter-1, GLT-1).因此,设法调控GLT-1,上调其表达和/或功能,可能有利于脑缺血疾病的防治.
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要由细胞外调节蛋白激酶(extracellular-signal regulatedprotein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase, JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogenactivated protein kinase,p38 MAPK)三条信号转导通路组成,在细胞增值、分化、凋亡中具有重要作用.p38MAPK是MAPK家族的重要成员,在脑缺血后调控神经元的存活中扮演着双重角色.有报道表明p38MAPK的激活会促进脑缺血后神经元的死亡.同时,越来越多的证据表明它的激活参与了缺血预处理(Ischemic preconditioning, IPC)诱导的神经保护作用.我室前期研究表明p38通过上调GLT-1参与脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受.最近有研究发现,SB203580可以提高癫痫大鼠脑组织中GLT-1的表达水平.本文旨在研究p38MAPK是否通过双向调节GLT-1参与脑缺血耐受和脑缺血损伤.
第一部分大鼠星形胶质细胞-神经元分层共培养体系及氧葡萄糖剥夺模型的建立
目的:
1确定大鼠星形胶质细胞与神经元分层共培养的天数;
2建立大鼠星形胶质细胞与神经元分层共培养的氧葡萄糖剥夺模型.
方法:
1观察星形胶质细胞与神经元分层共培养的天数对星形胶质细胞GLT-1表达的影响.取出生24h内新生鼠皮层进行神经元和星形胶质细胞的培养,随机分为6组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞单独培养,不与神经元进行共培养;
(2)共培养1d组:星形胶质细胞与神经元共培养1天;
(3)共培养2d组:星形胶质细胞与神经元共培养2天;
(4)共培养3d组:星形胶质细胞与神经元共培养3天;
(5)共培养4d组:星形胶质细胞与神经元共培养4天;
(6)共培养5d组:星形胶质细胞与神经元共培养5天.
上述各组在相应时间点收集细胞,Westernblot检测GLT-1蛋白的表达.
2确定OGD损伤的时间.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞与神经元不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧环境中培养;
(2)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,根据OGD时间不同,分别进行90min、120min、150min、180min、210min、240min的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
各实验组于OGD复氧后24h时间点收集细胞,Hoechst-PI染色法观察计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
3确定OGD预处理,即IPC的时间.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为4组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞与神经元共培养2天后,不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,分别进行30min、45min、60min的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(3)IPC+OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,先分别进行30min、45min、60min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中,24h后再进行4h的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(4)OGD4h:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4h的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
各实验组于末次OGD复氧后24h时间点收集细胞,Hoechst-PI染色法观察计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
结果:
1星形胶质细胞与神经元共培养可提高星形胶质细胞GLT-1的表达
Westernblot结果显示,与对照组相比,共培养1-5天的星形胶质细胞GLT-1表达均明显升高(P<0.05),其中从共培养2天开始GLT-1的表达趋于稳定.结果表明星形胶质细胞与神经元最适共培养天数为2天.
2不同时间的OGD可引起神经元不同程度的损伤
Hoechst-PI染色结果显示,对照组神经元胞核呈均匀蓝色荧光,形态规则,神经元死亡百分率为7.46±1.86%.与对照组相比,OGD各组引起了神经元不同程度的损伤(P<0.05),镜下可见胞核红色阳性率增加、染色质固缩.且随着OGD时间的延长,神经元的死亡率逐渐增加,OGD90min、120min、150min、210min、OGD240min分别为19.6±1.29%、29.18±1.64%、36±1.87%、47±1.92%、53.6±2.6%、59.97±3.26%.
MTS检测结果显示,与对照相比,OGD90min至240min均可显著降低神经元的活力(P<0.05),且随着OGD时间的延长,神经元活性越来越低.4hOGD可以使神经元活性降低到43.52±2.43%.
以上结果表明,星形胶质细胞-神经元分层共培养进行损伤性OGD的时间为4h.
3IPC可减轻由OGD引起的神经元损伤
Hoechst-PI染色结果显示,OGD30min、45min的神经元死亡率与对照组相比无显著性差异(P>0.05),OGD60min的神经元死亡率稍有增加,死亡率升高为11.76±1.74%(P<0.05).4hOGD神经元死亡百分率为59.97±3.26%.与4hOGD组相比,IPC+OGD各组均降低了神经元的死亡率(P<0.05),其中以45min+4hOGD保护作用尤为明显,神经元死亡率为42.12±1.34%.结果表明,45minOGD本身不影响神经元的存活,且对其产生了最大保护作用.
MTS检测结果显示,4hOGD可以使神经元活性降低到43.52±2.43%.与4hOGD组相比,IPC+OGD各组神经元活性明显增高(P<0.05).其中以45min+4hOGD神经元活性最高,为63.15±3.96%.OGD30min、45min的神经元活性与对照组相比无显著性差异(P>0.05);OGD60min与对照组相比神经元活性稍有下降(P<0.05),神经元活性降低为86.92±1.42%.
以上结果表明,45minOGD的保护作用最佳,接下来的实验中我们选择45minOGD作为OGD预处理的时间,即IPC.
小结:星形胶质细胞-神经元分层共培养的最适时间是2天;损伤性OGD的时间为4h;OGD预处理的时间为45min.
第二部分IPC是否通过激活星形胶质细胞p38MAPK调控GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤作用
目的:应用星形胶质细胞-神经元分层共培养技术,观察IPC对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响,探讨IPC是否通过激活星形胶质细胞p38MAPK调控GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤作用.
方法:
1观察IPC对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行IPC处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
于IPC后即刻、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h收集星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞GLT-1及p-p38MAPK的表达.于IPC后6h时间点收集星形胶质细胞,进行p-p38MAPK和GLT-1蛋白的免疫荧光双标检测.
2抑制p38MAPK对IPC后星形胶质细胞GLT-1表达的影响
2.1观察SB203580对IPC后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)SB+IPC组:IPC处理前30min给予SB203580处理,根据剂量不同,分为3个亚组,0.625μM、1.25μM和2.5μM,其余操作同IPC组(每个亚组n=3);
(3)DMSO+IPC组:IPC处理前30min给予SB203580处理,其余操作同IPC组.
上述各组于IPC后30min收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达.
2.2观察p38MAPKsiRNA对IPC后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)IPC组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行45min的OGD作为IPC,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)si-p38+IPC组:星形胶质细胞转染p38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理.根据siRNA剂量不同,分为3个亚组,1.25nM、2.5nM和2.5nM,其余操作同IPC组(每个亚组n=3);
(3)si-NC+IPC组:星形胶质细胞转染negativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理,其余操作同IPC组.
上述各组于IPC后30min收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达.
3抑制p38MAPK对IPC诱导的神经元保护的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为6组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行缺氧处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)IPC+OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,先进行45min的OGD,复氧24h后再进行4h的OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(3)SB203580+IPC+OGD组:IPC处理前30min给予2.5μMSB203580处理,其余操作同IPC+OGD组;
(4)si-p38+IPC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMp38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理,其余操作同IPC+OGD组;
(5)DMSO+IPC+OGD组:IPC处理前30min给予DMSO处理,其余操作同IPC+OGD组;
(6)si-NC+IPC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMnegativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行IPC处理,其余操作同IPC+OGD组.
各实验组于末次OGD复氧后24h收集细胞,Hoechst-PI染色法计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
结果:
1IPC可上调星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1的蛋白表达
Westernblot结果显示,对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白有一定量的基础表达.与对照组相比,p-p38MAPK从0min开始升高,并一直持续到6h(P<0.05),其中在30min时间点p-p38MAPK表达量最高,是对照组的5.58倍(P<0.05);随后p-p38MAPK的表达恢复到正常水平,12h、24h、48h时间点与对照组相比无显著差异(P>0.05).与对照组相比,GLT-1从30min开始显著升高,一直持续到48h,其中6h表达量达到高峰(P<0.05).
免疫荧光双标结果显示:对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1有一定量的基础表达,p-p38染色较浅,主要表达在胞核;GLT-1染色较浅,表达在胞膜.与对照组相比,IPC(6h)组p-p38MAPK在胞核的染色明显加深,表达增多(P<0.05).与对照组相比,IPC(6h)组GLT-1在胞膜染色明显加深,表达增多(P<0.05).
以上结果表明,IPC引起了星形胶质细胞p38MAPK的激活以及GLT-1表达的上调,且p38MAPK的激活早于GLT-1的上调.
2抑制p38MAPK可以剂量依赖性地下调p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达.
Westernblot结果显示,在30min时间点,与IPC组相比,SB203580+IPC组,随着SB203580(0.625μM、1.25μM、2.5μM)剂量的加大,IPC后p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达呈剂量依赖性地下调.DMSO+IPC组与IPC组相比,p-p38MAPK和GLT-1表达均无显著变化(P>0.05).
Westernblot结果显示,在30min时间点,与IPC组相比,si-p38+IPC组,随着p38MAPKsiRNA(1.25 nM、2.5 nM、5 nM)剂量的加大,IPC后p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达呈剂量依赖性地下调.si-NC+IPC组与IPC组相比,p-p38MAPK和GLT-1表达均无显著变化(P>0.05).
上述结果表明,SB203580或p38MAPKsiRNA均可以剂量依赖性地下调p-p38MAPK及GLT-1蛋白的表达.
3抑制p38MAPK可以阻断IPC诱导的神经保护作用
Hoechst-PI结果显示,IPC+OGD组神经元死亡率为42.12±1.95%.与IPC+OGD组相比,IPC前30min给予星形胶质细胞-神经元分层共培养体系2.5μM的SB203580,可使SB203580+IPC+OGD组神经元的死亡率增加到59.72±3.87%(P<0.05).与IPC+OGD组相比,给予星形胶质细胞5nM的p38MAPKsiRNA,2天后再与神经元进行共培养,可使si-p38+IPC+OGD组神经元的死亡率增加到58.9±2.82%(P<0.05).DMSO+OGD组和si-NC+OGD组与IPC+OGD组相比,神经元死亡率均无明显改变(P>0.05).
MTS结果显示,与control组相比,IPC+OGD组神经元活性为62.48±2.35%.与IPC+OGD组相比,IPC前30min给予星形胶质细胞-神经元分层共培养体系2.5μM的SB203580,可使SB203580+IPC+OGD组神经元的活性降低到44.34±1.33%(P<0.05).与IPC+OGD组相比,给予星形胶质细胞5nM的p38MAPKsiRNA,2天后再与神经元进行共培养,可使si-p38+IPC+OGD组神经元的活性降低到44.23±1.77%(P<0.05).DMSO+IPC+OGD组和si-NC+IPC+OGD组与IPC+OGD组相比,神经元活性均无明显变化(P>0.05).
上述结果表明,抑制p38MAPK可以阻断IPC诱导的神经保护作用.
小结:IPC通过适度激活星形胶质细胞p38MAPK上调GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤.
第三部分全脑缺血是否通过激活星形胶质细胞p38MAPK调控GLT-1表达介导脑缺血损伤
目的:
1观察全脑缺血对大鼠海马CA1区神经元存活以及p-p38MAPK和GLT-1表达的影响;
2应用星形胶质胞-神经元分层共培养技术,观察OGD对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响,探讨OGD是否通过激活p38MAPK调控GLT-1表达介导神经元损伤;
3抑制p38MAPK对全脑缺血后大鼠海马CA区神经元存活及GLT-1表达的影响.
方法:
1采用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型,观察全脑缺血对大鼠海马CA1区神经元存活以及p-p38MAPK和GLT-1表达的影响.选用健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为2组(n=15):
(1)sham组:不凝闭椎动脉,只暴露双侧颈总动脉;
(2)脑缺血(ischemia, IS)组:永久性凝闭椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流再灌注.
各组大鼠于假手术或全脑缺血手术后7d断头取脑,通过硫堇染色进行神经病理学评价;于6h、2d断头取海马脑组织,应用Westernblot法检测GLT-1和p-p38MAPK蛋白的表达(每个时间点n=5).
2采用星形胶质细胞-神经元分层共培养,观察OGD是否通过激活p38MAPK下调星型胶质细胞GLT-1表达介导神经元损伤
2.1观察OGD对星形胶质细胞p-p38MAPK及GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为2组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中.
于损伤性OGD后即刻、15min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h收集星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达;于损伤性OGD后6h、24h收集星形胶质细胞,进行p-p38MAPK和GLT-1蛋白的免疫荧光双标检测.
2.2观察SB203580和p38MAPKsiRNA对OGD后神经元存活的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为6组(n=3):
(1)对照组:星形胶质细胞-神经元不进行OGD处理,继续在正常培养基及常氧培养箱中培养;
(2)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(3)SB+OGD组:OGD处理前30min给予SB203580处理,根据剂量不同,分为3个亚组,0.625μM、1.25μM和2.5μM,其余操作同OGD组;
(4)si-p38+OGD组:星形胶质细胞转染p38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行OGD处理.根据siRNA剂量不同,分为3个亚组,1.25nM、2.5nM和5nM,其余操作同OGD组(每个亚组n=3);
(5)DMSO+OGD组:OGD处理前30min给予SB203580处理,其余操作同OGD组;
(6)si-NC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMnegativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行OGD处理,其余操作同OGD组.
各实验组于OGD复氧后24h时间点收集神经元,Hoechst-PI染色法计数神经元死亡百分率,MTS法检测神经元活力.
2.3抑制p38MAPK对OGD后星形胶质细胞GLT-1表达的影响
2.3.1观察SB203580对OGD后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)SB203580+OGD组:4hOGD处理前30min给予2.5μMSB203580处理,其余操作同OGD组;
(3)DMSO+OGD组:4hOGD处理前30min给予DMSO处理,其余操作同OGD组.
上述各组于OGD后6h、24h时间点收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达(每个时间点n=3).
2.3.2观察p38MAPKsiRNA对OGD后星形胶质细胞GLT-1表达的影响.分层共培养的大鼠星形胶质细胞-神经元,随机分为3组(n=3):
(1)OGD组:星形胶质细胞-神经元更换无糖培养基,进行4hOGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱中;
(2)si-p38+OGD组:星形胶质细胞转染5nMp38MAPKsiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行4hOGD处理,其余操作同OGD组;
(3)si-NC+OGD组:星形胶质细胞转染5nMnegativesiRNA48h,然后与神经元进行共培养,2天后进行4hOGD处理,其余操作同OGD组.
上述各组于OGD后6h、24h时间点收取星形胶质细胞,Westernblot法检测星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白的表达.
3采用大鼠四血管闭塞全脑缺血模型,观察SB203580对全脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元存活及GLT-1表达的影响
3.1观察SB203580对全脑缺血后大鼠海马CA1区锥体神经元存活的影响.选用健康雄性Wistar大鼠25只,随机分为3组:
(1)IS组(n=5):永久性凝闭椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流再灌注;
(2)SB203580+IS(n=15)组:夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射SB203580,根据剂量不同,又分为3个亚组,0.625nmol、1.25nmol和2.5nmol,其余步骤同IS组;
(3)DMSO+IS组(n=5):夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射10μlDMSO,其余步骤同IS组.
各组大鼠于全脑缺血手术后7d断头取脑,通过硫堇染色进行神经病理学评价.
3.2观察SB203580对全脑缺血后大鼠海马CA1区GLT-1表达的影响.选用健康雄性Wistar大鼠15只,随机分为3组:
(1)IS组(n=5):永久性凝闭椎动脉,2天后夹闭双侧颈总动脉8min后恢复血流再灌注;
(2)SB203580+IS组(n=5):夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射2.5nmolSB203580,其余步骤同IS组;
(3)DMSO+IS(n=5)组:夹闭颈总动脉30min前右侧脑室注射10μlDMSO,其余步骤同IS组.
各组大鼠于全脑缺血手术后6h、2d断头取海马脑组织,应用Westernblot法检测GLT-1蛋白的表达.
结果:
18min全脑缺血引起了海马CA1区锥体神经元的死亡、GLT-1表达减少及p-p38MAPK的表达增多
硫堇染色结果显示,sham组大鼠海马CA1区锥体神经元形态完整,胞核饱满,核仁清晰,神经元排列整齐,为2~3层,神经元密度(ND)值为207.2±6.99.IS组海马CA1区神经元大片死亡或缺失,并可见大量细胞碎片,与sham组相比,ND值显著下降,为27.4±3.56(P<0.05).实验结果表明,8min全脑缺血引起海马CA1区锥体神经元迟发性死亡.
Westernblot结果显示,sham组大鼠海马CA1区GLT-1有一定量的基础表达.sham(6h)组和sham(2d)组相比,GLT-1表达无明显差异(P>0.05).与sham(6h)组相比,IS(6h)组GLT-1表达明显下调(P<0.05).与sham(2d)组相比,IS(2d)组GLT-1明显下调(P<0.05).结果表明,8min全脑缺血引起海马CA1区GLT-1表达减少.
Westernblot结果显示,sham组大鼠海马CA1区p-p38MAPK有一定量的基础表达.sham(6h)组和sham(2d)组相比,p-p38MAPK表达无明显差异(P>0.05).与sham(6h)组相比,IS(6h)组p-p38MAPK显著上调(P<0.05).与sham(2d)组相比,IS(2d)组p-p38MAPK显著上调(P<0.05).结果表明,8min全脑缺血引起海马CA1区p-p38MAPK表达增多.
2OGD通过激活星形胶质细胞p38MAPK下调GLT-1介导神经元损伤
2.1OGD引起了星形胶质细胞p38MAPK的激活以及GLT-1表达的降低
Westernblot结果显示,对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1蛋白有一定量的基础表达.OGD组各个时间点p-p38MAPK的表达与对照组相比均明显升高(P<0.05),但以12h表达量最高,是对照组的12.45倍.与对照组相比,GLT-1蛋白在0min、15min、30min三个时间点有短暂的升高(P<0.05),从1h开始降低,随着时间的推移逐渐降低,在6h、12h、24h和48时间点均明显下调(P<0.05).
免疫荧光双标结果显示,对照组星形胶质细胞p-p38MAPK和GLT-1有一定量的基础表达,p-p38染色较浅,主要表达在胞核;GLT-1染色较浅,表达在胞膜.与对照组相比,p-p38MAPK在6h和24h时间点在胞核的染色显著加深,表达增多(P<0.05);而GLT-1在6h和24h在胞膜的着色明显变浅,表达减少(P<0.05).
以上结果表明,OGD引起了星形胶质细胞p38MAPK的激活以及GLT-1表达的降低.
2.2抑制p38MAPK剂量依赖性地减轻OGD导致的神经元损伤
Hoechst-PI染色结果显示,与OGD组相比,提前给予SB203580或p38MAPKsiRNA可以剂量依赖地降低神经元的死亡率(P<0.05),2.5μM的SB203580和5nM的siRNA疗效最好,可以使神经元的死亡率降低到43.06±2.29%和42.56±3.83%.DMSO+OGD组和si-NC+OGD组与OGD组相比,神经元死亡率无明显差异(P>0.05).
MTS结果显示:与OGD组相比,提前给予SB203580或p38MAPKsiRNA可以剂量依赖地增加神经元的活性,2.5μM的SB203580和5nM的siRNA疗效最好,可以使神经元的活性增加到63.79±1.51%和62.20±4.00%(P<0.05).DMSO+OGD组和si-NC+OGD组与OGD组相比,神经元活性无明显差异(P>0.05).
Hoechst-PI染色结合MTS检测的结果表明,应用SB203580或p38MAPKsiRNA抑制p38MAPK可剂量依赖性地减轻OGD导致的神经元损伤,其中,2.5μM的SB203580和5nM的siRNA的保护效果最好.
2.3抑制p38MAPK能够逆转OGD引起的星形胶质细胞GLT-1表达下调
Westernblot结果显示,与OGD组相比,提前给予2.5μM的SB203580或5nMp38MAPKsiRNA可以上调损伤性OGD后星形胶质细胞GLT-1的表达(P<0.05).DMSO或NegativesiRNA对GLT-1的表达无明显影响(P>0.05).
结果表明,应用SB203580或p38MAPKsiRNA抑制p38MAPK可逆转由OGD引起的GLT-1表达下调.
3SB203580剂量依赖性地减轻全脑缺血后大鼠海马CA1区神经元的损伤,并且逆转由全脑缺血引起的海马CA1区GLT-1表达下调
3.1SB203580剂量依赖性地减轻全脑缺血后大鼠海马CA1区神经元的损伤
硫堇染色结果显示,IS组海马CA1区可见神经元大片死亡或缺失,ND值为27.4±3.56.SB203580+IS组中,随着SB203580剂量的增大可见海马CA1区锥体神经元损伤减轻:0.625nmol组与IS组相比ND值无明显差异(P>0.05);1.25nmol组可见CA1区神经元数量有所增加,细胞排列较松散,与IS组相比,ND值明显升高为132.2±5.21(P<0.05);2.5nmol组CA1区神经元状态明显改善,细胞形态较完整,排列较整齐,与IS组相比,ND值显著升高为165.0±6.0(P<0.05).
3.2SB203580逆转由全脑缺血引起的海马CA1区GLT-1表达下调
Westernblot结果显示,在6h时间点,与IS组相比,提前30min经侧脑室注射2.5nmol的SB203580可显著上调全脑缺血后GLT-1表达(P<0.05);在2d时间点,与IS组相比,SB203580(2.5nmol)+IS组GLT-1表达明显升高(P<0.05).在6h和2d时间点,DMSO+IS组与IS组相比,GLT-1的表达均无明显变化(P>0.05).
上述结果表明,SB203580可以剂量依赖性地减轻全脑缺血后海马CA1区神经元的损伤以及逆转由全脑缺血引起的海马CA1区GLT-1表达下调.
小结:全脑缺血通过过度激活p38MAPK下调GLT-1表达介导脑缺血损伤.
结论:
(1)星形胶质细胞与神经元共培养的最适时间是2天;星形胶质细胞-神经元OGD损伤的时间为4h;星形胶质细胞-神经元OGD预处理的时间为45min.
(2)IPC通过适度激活星形胶质细胞p38MAPK上调GLT-1表达发挥抗氧葡萄糖剥夺引起的神经元损伤作用.
(3)全脑缺血通过过度激活p38MAPK下调GLT-1表达介导脑缺血损伤.
上述结果表明,p38MAPK的激活犹如一把双刃剑,IPC通过适度激活p38MAPK上调GLT-1参与IPC诱导的神经保护作用;全脑缺血通过过度激活p38MAPK下调GLT-1的表达介导脑缺血损伤.