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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)属于里氏杆菌属黄杆菌科,革兰氏染色为阴性的短小杆菌,美兰染色为两极浓染,是感染鸭、野鸭、雏鹅等水禽而引起一种急性、败血性传染病的病原,细菌的生化反应不活泼,对营养要求较高。R.anatipestifer血清型较多,有21种,每种血清型之间的交叉保护力差。首先,本研究选取临床中疑似鸭疫里默氏杆菌感染病例的大脑进行病原菌分离、培养和鉴定。分离的疑似细菌在培养基中呈光滑、圆润且带蓝绿色光环的小菌落,挑取细菌染色镜检,为革兰氏阴性,菌体呈短杆状;瑞氏染色呈两极浓染;生化反应不活泼。据此,初步判断为鸭疫里默氏杆菌。进一步应用PCR方法扩增细菌的16S rRNA,进行同源序列比对。结果显示,所分离到菌株的16S rRNA与NCBI中报道的鸭疫里默氏杆菌同源性为99%以上,玻片凝集试验结果显示本次分离到的5株R.anatipestifer血清型主要是1、2和10型。动物回归性实验显示,所分离的5株为强致病性鸭疫里默氏杆菌,致死率达到100%,具有典型鸭疫里默氏杆菌感染的症状,从病死幼龄鸭子中又分离到R.anatipestifer。其次,用PCR方法对5株强毒株R.anatipestifer的外膜蛋白A(ompA)进行扩增,并用分子生物学软件进行蛋白结构分析,发现5株不同来源的ompA同源性在98%以上,说明鸭疫里默氏杆菌的ompA在不同血清型之间具有高度同源性。运用分子生物学手段预测其B细胞表位,PCR扩增获得B细胞表位相关表位,琼脂糖凝胶电泳显示其基因大小为408bp。将获得的基因片段通过双酶切与PET-32a/PGEX-4T-1空载体连接构建重组质粒ET-32a-ompA/APGEX-4T-1-ompA。将重组质粒转染大肠杆菌Rostta(DE3)构建重组菌进行诱导表达,对获得重组融合蛋白His-ompA/GST-ompA进行表达和最佳表达条件的优化。SDA-PAGE凝胶电泳显示该融合蛋白大小为37kD/41kD。用Ni2+/GST亲和层析对融合蛋白进行纯化,将纯化的His-ompA蛋白进行SPF小鼠免疫三次,眼球采血处死,摘取免疫后小鼠脾脏与培养好的骨髓瘤细胞进行融合以制备小鼠单克隆抗体。以纯化后的GST-ompA作为抗原进行免疫原性和单克隆抗体的筛选,并对筛选的条件进行优化。Western-bolt检测结果表明,原核表达的融合蛋白His-ompA具有很好的免疫原性。共获得3株小鼠抗R.anatipestifer外膜蛋白A的单克隆抗体,其中一株的抗体效价最高,达到1:256000。将制备的单克隆抗体检测临床中疑似R.anatipestifer感染病例,结果发现,所制备的单克隆抗体特异性较高。结论,本实验建立临床分离和鉴定R.anatipestifer的方法,同时对毒性较强毒株进行血清学鉴定,并分析和克隆R.anatipestifer菌的ompA基因,进行原核蛋白的表达和纯化,最终制备检测R.anatipestifer的单克隆抗体。这为临床快速检测R.anatipestifer病建立ELISA方法。