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古菌作为三界生命之一,在生命进化上有着重要地位,一般认为古菌与真核生物更为相似,是后者的祖先。相比真核生物,古菌代谢过程简单,参与蛋白少,是良好的研究对象。嗜热古菌是一类特殊的古菌,主要栖息在70-100℃的高温环境中,具有重要的理论研究和应用价值,应用中作为热稳定性酶的重要来源。DHH型磷酸酯酶是具有一个由3个连续的氨基酸残基(DHH)构成的保守motif的一大类磷酸酯酶超家族的总称,其各亚家族成员广泛参与核酸与核苷酸衍生物的分解代谢,但不同亚家族成员的生物功能不同,彼此间的氨基酸残基序列相似性也很低。对DHH型磷酸酯酶在细菌核酸与核苷酸衍生物代谢中的功能与作用机制的了解较为清晰,而对其在古菌的相关代谢过程中的认识非常欠缺。本文以Pyrococcus属的两种嗜热古菌Pyrococcus yayanosii和Pyrococcus furiosus为研究对象,综合利用酶学、结构生物学及分子遗传学等技术手段,重点开展了DHH型磷酸酯酶超家族中的磷酸二酯酶PDE(phosphodiesterase)与核酸酶HAN(Hef-associated nuclease)的酶学特征及生理功能等相关研究,初步阐明了二者在降解核苷类信号分子c-di-AMP与DNA损伤修复中的主要功能,加深了对Pyrococcus属嗜热古菌核酸与核苷酸衍生物代谢的认识。首次发现在嗜盐古菌Haloferax volcanii细胞内存在核苷类信号分子c-di-AMP,其浓度约为3.742 μM。同时对嗜热古菌P.yayanosii CH1的核苷类信号分子c-di-AMP的代谢机制研究发现了一个负责降解核苷类信使分子的磷酸二酯酶。P.yayanosii PDE(PyaPDE)可以水解c-di-AMP,c-di-GMP和cGAMP等核苷类信号分子,并以c-di-AMP为优势底物。同时,PyaPDE水解核苷类信号分子具有明显的核糖依赖性,核糖型环二核苷酸底物水解效率明显高于脱氧核糖型底物。进一步的底物特异性分析表明,c-di-AMP/c-di-GMP的线性分子pApA/pGpG是PyaPDE优势底物,而ApAp/GpGp与ApA/GpG不能被其水解。不同于细菌DHH型PDE,PyaPDE是一个多结构域的磷酸二酯酶,包括N末端的NAD+结合结构域和C末端的DHH-DHH A1结构域。磷酸二酯酶活性存在于DHH-DHHA1结构域,NAD+结合结构域不具有酶活性。虽然添加NAD+并未显著影响PyaPDE水解c-di-NMPs的活性,但是仅保留DHH-DHHA1结构域的截短体蛋白的磷酸二酯酶活性显著降低,且Km值增高。该结果表明:DHH-DHHA1结构域是PyaPDE发挥磷酸二酯酶活性的必需结构域;NAD+结合结构域有助于PyaPDE结合底物从而提高催化效率。序列保守性分析与氨基酸定点突变实验确定了参与结合底物、初产物(线性二核苷酸)、二价金属离子的必需氨基酸残基等。在鉴定了PyaPDE酶学活性的基础上,利用基因敲除与表型鉴定的方法,对嗜盐古菌H.volcanii的pde基因的核酸代谢功能进行了研究。结果表明,删除pde基因导致嗜盐菌H.volcanii耐受氧化试剂(0.5 mMH2O2)的能力有所下降,显示pde基因在胞内可能参与拮抗氧化胁迫。本文还探究了嗜热古菌P.furiosus编码的HAN(PfuHAN)核酸酶的DNA损伤修复功能。生物信息学比对分析表明HAN是一个多结构域的DHH超家族蛋白,广泛存在于广古菌门。除C端的DHH-DHHA1核酸酶结构域外,PfuHAN还包含N端的锌指结构(Zn-finger),OB-Fold和S1-like型核糖体蛋白等结构域。酶活性分析表明PfuHAN具有ssDNA特异的3’-5’外切酶活性,酶活性以二价锰离子和镁离子为金属辅因子,较适反应温度范围55-70℃,最适pH值为8.0。PfuHAN可以水解ssDNA和ssRNA,无明显的核糖选择性。ssDNA长度偏好性为6-30 nt,ssRNA长度偏好性为4-16 nt。此外,3’末端磷酸基团对PfuHAN外切酶活性有显著抑制作用。PfuHAN也可以水解具有3’单链结构的dsDNA,并能够将双链DNA部分也最终降解成单核苷酸。PfuHAN结构域截短实验表明C端的DHH-DHHA1 Nuclease Domain(DND)是外切酶活性所必需的。虽然N末端结构域没有核酸酶活性,但其锌指结构、OB-Fold和S1-like型核糖体蛋白等结构域,有助于提高PfuHAN的C端核酸酶结构域的催化效率,推测是通过提高PfuHAN与底物的结合力而实现的。解析的DND晶体结构显示其为三聚体构型,亚基间的相互作用力主要是盐桥和氢键。破坏这些盐桥和氢键相互作用会导致DND三聚体结构的比例显著减少,并主要以单体存在;同时三聚体结构的破坏使得酶活性显著降低。DND晶体结构的催化中心存在二价金属离子Mn2+,DHH超家族蛋白共有的几个天冬氨酸保守残基负责Mn2+的结合。DND晶体结构与单链DNA的分子动力学模拟进一步确定了结合底物的关键氨基酸残基。负责结合Mn2+与底物的保守残基突变导致外切酶活性的丧失或极大的降低。为了确定HAN在DNA修复中的可能功能,本研究通过删除嗜盐古菌H.volcanii的han基因,并测定突变株对DNA损伤试剂耐受程度的变化,初步阐明了HAN的体内DNA修复功能。当删除han基因时,菌株耐受DNA损伤试剂MMS的能力变弱,细胞内累积的甲基化嘌呤损伤增多,暗示han基因可能参与MMS导致的DNA损伤的修复过程。该修复功能主要依赖于C端的核酸酶肽段,暗示HAN的核酸酶活性对修复至关重要。本文研究结果加深了对古菌DHH型磷酸酯酶在降解核苷类信号分子c-di-AMP/GMP和修复DNA损伤方面的功能与作用机制的认识。