目的:常用中药檀香为檀香SantalumalbumL.植株树干心材,有行气止痛之功效。自然条件下,檀香心材形成极其缓慢,一般需经30年以上方能成材以供药用。已报道的人工结香方法仅能使檀香植株局部结香(形成心材),难以实施产业化。为此,笔者开展了生物诱导法诱导檀香整体结香技术研究,并初步评价结香样品质量,以期为该常用中药材生产的现代化提供一些科学依据。方法:一、诱导结香实验研究(一)诱导结香方式的筛选参考前人诱导结香方式,选取5年生健康檀香植株作为实验对象,设计打1孔注液、打2孔注液及输液组,观察记录1周、1个月、3个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录实验后1个月、3个月、6个月、12个月檀香心材颜色、气味等情况,选择最佳诱导方式。(二)诱导物质的筛选选取5年生健康檀香植株作为实验对象,分别设计噻苯隆、青鲜素、醋酸、双氧水、甲酸、生物诱导剂组别,观察记录1周、1个月、3个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录1个月、3个月、6个月、12个月檀香心材颜色、气味等情况,选择最佳诱导物。(三)生物诱导剂最佳浓度及最佳用量的优选选取5年生健康檀香植株作为实验对象,分别设计1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%浓度的生物诱导剂组别、用量分别为60、70、80、90、100mL,实验后观察记录1周、1个月、3个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,详细记录实验后6个月、9个月、12个月檀香心材颜色、气味等情况,以12个月后质量和产量作为关键评价指标,选择最佳浓度及用量。(四)檀香诱导结香技术最佳条件验证及优化选取5年生健康檀香植株作为实验对象,每组5株,分为A组(滴注2.5%生物诱导剂80mL)、B组滴注1.5%生物诱导剂80mL)、C组(滴注2.5%生物诱导剂80mL,去叶),观察记录1周、1个月、3个月、6个月的树叶、枝条、树干生长情况,同时详细记录实验后1个月、3个月、6个月檀香心材颜色、气味等情况,同时以6个月后产量作为评价指标,对生物诱导法结香技术进行优化及验证。二、檀香诱导结香产量与样品质量分析研究(一)檀香诱导结香产量及结香样品质量分析檀香诱导结香产量计算采用体积法,用钻孔法观察并记录结香高度,胸径,计算公式为结香体积=3.14X(胸径/2)2X高度。将市售不同批次样品、诱导结香6个月、12个月及基地自然结香药材样品进行品质分析。按2015年版《中国药典》(一部)中檀香项下方法要求,对实验样品进行性状、显微、薄层检测。依照《中国药典》2015年版(四部)通则0832“水分测定法”项下“第四法(甲苯法)”测定水分;用乙醚冷浸法测定乙醚浸出物含量;照2015版《中国药典》(四部)通则2204挥发油测定“甲法”测定檀香挥发油含量。(二)檀香结香样品中9种无机元素含量测定采用原子吸收分光光度计火焰法和石墨炉法测定15批檀香样品中9种无机元素:Cu、Fe、Zn、Mn、Ca、Pb、As、Hg、Cr的含量,采用SPSS20.0对含量结果进行主成分分析、相关性分析以及聚类分析。(三)檀香结香样品HPLC指纹图谱研究KromasilC18 色谱柱(5.0μm,4.6×250mm);流动相:0.2%磷酸水溶液(C,v/v)-乙腈,梯度洗脱;流速:1mL/min;检测波长254nm;柱温:25℃;进样量:10μL。采用HPLC-UV法建立不同批次檀香样品的指纹图谱,运用国家药典委“中药指纹图谱相似度评价软件2004A版”12批样品进行图谱分析比较,确定共有峰及相似度,运用SPSS20.0软件进行聚类分析。(四)檀香结香样品挥发油成分分析及GC-MS指纹图谱研究采用气质-质谱联用仪分析15批檀香样品中的化学成分。HP-5石英毛细管柱,进样口温度 270℃;升温程序:柱温 90℃,以 5℃.min-1→160℃,再以0.5℃.min-1→165℃,然后再以1℃·min-1→180℃,最后以10℃min-1的速率→230℃。汽化室温度:250℃,载气为高纯氦气;柱前压:52.6kPa,载气流量:1.0mL·min-1;进样量:1μL;分流比为20:1。对檀香挥发油进行成分分析并建立指纹图谱,采用“中南大学相似度评价软件”进行相似度分析,应用SPSS20.0统计软件对数据进行聚类分析,建立控制檀香挥发油质量的方法。结果:一、诱导结香实验研究(一)诱导结香方式对檀香结香的影响三种方法实验组一周后都出现落叶现象,约1个月后慢慢恢复,3个月后诱导孔部位出现棕色物质,质坚实,燃烧时有香味,约6个月后,大部分注射结香剂的树体在诱导孔周围变棕红色,而空白对照组及阴性对照组均无此现象出现。6个月及1年后凿开及截断树体进行观察,打1孔注液法、打2孔注液法及输液注液法均可形成棕红色心材类物质,三种诱导方式所产心材类物质产量有显著差异,输液法所影响区域均明显大于打1孔及2孔注液法,且输液法对药液输送速度最快。(二)诱导物质对檀香结香的影响研究青鲜素组、甲酸组、乙酸组、生物诱导剂及噻苯隆组均能使檀香结香,双氧水组未产生结香效果,诱导物质对檀香结香产量从高到低为:生物诱导剂>噻苯隆>青鲜素>甲酸>乙酸>双氧水,且生物诱导剂诱导檀香1年所产的药材颜色棕黄、香味浓烈,心材直径显著大于其它组别,品质最佳。(三)生物诱导剂最佳浓度及用量的优化研究2.5%浓度下,檀香实验植株一年后心材长度可达248.3cm,直径达4.9cm,心材颜色深红、质硬、香气浓烈,优于1%、1.5%及2%浓度下实验组别结香心材,3%及3.5%浓度下,出现树体枯萎或死亡现象;2.5%浓度生物诱导剂下,80mL诱导组别所产心材长度达258.3cm,宽度4.6cm,心材品质优于其它用量组别,90mL及1OOmL用量时,植株出现枯萎、腐烂及死亡现象。(四)檀香诱导结香的最佳条件验证及优化研究生物诱导剂3组檀香,结香产量达2495.92cm3/半年,显著高于生物诱导剂A组(年均产量1972.88 cm3/半年)及生物诱导剂B组(年均产量624.98cm3/半年),生物诱导剂C组样品心材颜色、气味均已达到10年生自然结香檀香,将结香点提前了 10年,且能从根部至树干191.70 cm处整体结香。二、生物诱导法诱导檀香产量与结香样品质量分析研究(一)檀香诱导结香产量与样品常规鉴别性状鉴别结果显示,6个月方有药用心材类物质形成,12个月所产心材品质较佳,产量平均约4243.12cm3,心材颜色为棕红色,质地坚实,不容易折断。气味清香,香气浓。显微鉴别发现诱导结香均含药典规定的具缘纹孔导管、草酸钙方晶、含晶厚壁细胞等物质,但不同样品间这些基本特征的量或形态上存在一定的差异,诱导结香样品色素块相对较少,纤维、木纤维及木射线为浅棕黄色,方晶多;薄层色谱鉴别发现诱导结香6个月及12个月的样品与檀香油对照品在不同Rf处位置有相同的斑点;含水量、醚浸出物含量测定结果显示诱导6、12个月结香样品含水量在11.75～11.96%、乙醚浸出物在1.45%～3.03%;诱导6个月样品挥发油含量为1.14%,诱导12个月样品挥发油含量达2.84%。市售檀香样品挥发油含量在1.49%～3.84%之间。(二)檀香结香样品中9种无机元素含量测定各无机元素平均含量(μg/g)由高到低依次为:Cu(3.5110～52.6808,平均18.7420)>Fe(0.1840～22.7640,平均 6.4791)>Mn(1.1923～23.2843,平均 5.0050)>Cr(0.4112～12.7130,平均 1.7584)>Cd(0.0550～0.6045,平均 0.2104)>Hg(0.0041～0.7431,平均 0.1066)>As(0.0242～0.0856,平均 0.0409)>Pb(0.0055～0.3405,平均 0.0851)>Zn(0.0053～0.0915,平均 0.0252)。主成分分析结果得出,第1主成分特征值为3.521,特征向量较大的元素有Mn、As、Zn、Hg、Cr,分别为 0.946、0.922、0.790、0.759、0.602。第 2 主成分主要是 Fe、Pb、Cu、Cd、As 元素,特征向量值为 0.764、0.748、-0.499、0.320、-0.233。第 3 主成分主要含量线性组合有:Cr、Cd、Zn、Cu、Fe元素,特征向量值分别为-0.594、0.584、0.545、0.292、0.101。第4主成分含量线性组合主要有:Cd、Cr、Cu、Pb、Zn元素,特征向量值分别为0.503、0.474、0.438、-0.311、-0.171。结合主成分分析,相关性分析及聚类分析,提示Mn、As、Zn、Hg、Cr可能是檀香的特征无机元素。诱导结香样品与大部分自然结香样品的无机元素含量一致。无机元素含量测定结果表明,Mn、Zn、As、Hg、Cr可能为檀香的特征无机元素,其中,Mn、Zn为微量元素,可进一步探究Mn、Zn与檀香药效间的关系,As、Hg、Cr为重金属元素,对于后期制定檀香重金属限量标准提供了研究基础。相关性分析结果得出,Zn与Mn、Hg与Mn在0.05水平上呈显著正相关,Mn和Cr、Zn和Hg、Zn和As、Mn和As、Hg和As在0.01水平上呈显著正相关。其他元素间的相关性未达到显著水平。聚类分析结果得出,以10为距离,可将15份样品分为3类。第1类:S2、S4、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S15样品,该类样品中Cu元素的含量较高;第2类为S13、S14样品,各样品元素含量较为一致;S1、S3、S5可聚为一类,该类样品含Cu和Fe较多。对9种元素进行R型因子聚类分析,以20为距离,可将9种元素划分为4类。第1类为Mn、As、Hg、Zn、Cr,结合相关分析表明二者相关性较大,在主成分分析中属第1主成分;第2类为Cu;第3类为Pb、Fe,二者同属第2主成分。第4类为Cd。不同产地的各元素含量变异系数在存在着较大差异。可能与产地环境、气候等有关,对元素的吸收、输送有影响,以及富集程度不一样所致。(三)檀香结香样品HPLC指纹图谱研究12批檀香样品HPLC指纹图谱与产生的对照图谱R的相似度在0.466-0.703之间以10为距离,聚类分析将12批样品可分为4类,其中诱导6个月、12个月样品、大部分市售样品与对照品列为一类。(四)檀香结香样品挥发油成分分析及GC-MS指纹图谱研究檀香挥发油对照品主要含α-檀香醇、β-檀香醇,两成分含量高达75%,诱导结香6个月檀香样品两成分含量较低,而诱导结香12个月样品两成分含量达66%。15批样品挥发油(包括市售样品、檀香油对照品、檀香诱导结香挥发油样品)相似度在0.622～0.984之间,差异较大,生物诱导法结香心材挥发油相似度在0.812-0.886之间,相似度较高,聚类分析结果将15批样品分为2类,诱导结香6个月及12个月样品与檀香挥发油对照品在聚类分析中列为一类。结论:一、诱导结香实验研究最佳诱导结香方法为:输液法;诱导结香剂:生物诱导剂;诱导结香剂浓度:2.5%;结香剂用量:80mL;去叶。该法所产檀香结香心材品质坚实、颜色棕黄、香气浓烈。结香时间点提前了 10年以上,对檀香的生产及综合利用具有重大意义。而诱导结香的最适季节、心材采收时间、结香剂在檀香植株中的输导等需要更进一步的研究。二、生物诱导法诱导檀香结香样品质量分析研究生物诱导法诱导结香植株半年心材长度可达191.7cm,心材直径4.3cm,半年产量15767.1cm3,挥发油含量达2.84%。诱导结香一年后的样品性状、显微、薄层、含水量、乙醚浸出物含量及挥发油含量等暂未达到药典要求,但已高于大部分市售样品质量。其GC-MS指纹图谱与檀香挥发油对照品聚为一类。综上,生物诱导法是一种能有效诱导檀香整体结香的方法。