论文部分内容阅读
近年来,化学发光分析方法因其灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单等优点被广泛用于生物医学分析。鲁米诺化学发光由于具有较高的量子产率和较好的水溶性而成为研究最多的发光体系。随着纳米材料的出现,化学发光分析得以飞速发展,但有关长时间化学发光功能化复合材料和二维类石墨烯参与的化学发光生物分析的研究鲜少报道。基于此,本论文以氧化石墨烯为反应平台,合成了具有长时间化学发光性质的纳米复合材料,探讨其发光机理,并将其用于生物小分子的测定;又以石墨相氮化碳纳米片和氧化石墨烯为分析界面,开发了基于电子转移和能量转移的化学发光生物分析方法,实现了一系列生物分子的检测。具体研究内容包括以下三个方面:（1）合成了具有长时间化学发光性质的还原型氧化石墨烯/金纳米/鲁米诺复合材料,并将其用于胆固醇的测定。鲁米诺和正电荷金纳米颗粒分别通过?-?堆积和静电吸附作用沉积在氧化石墨烯表面,形成鲁米诺和金纳米颗粒双功能化的还原型氧化石墨烯纳米复合材料。该复合材料在碱性条件下与过氧化氢反应能产生长时间化学发光。机理研究表明:还原型氧化石墨烯与金纳米颗粒的协同催化作用诱导产生大量自由基使鲁米诺的发光时间延长;还原型氧化石墨烯不仅促使·OH和O2·-在其共轭平面发生重组反应生成1O2,并且诱导·OH在其共轭双键上发生加成反应产生大量的?–C=C·,直接激发鲁米诺产生长时间化学发光。结合酶与底物反应产生过氧化氢,将所制备的复合材料用于胆固醇的定量检测,所得线性范围是0.71μM–11.43μM,检测限为0.55μM。通过引入其他酶和底物,该方法能进一步拓展到多种生物分子的检测。（2）石墨相氮化碳纳米片能有效猝灭鲁米诺–过氧化氢体系的化学发光,猝灭机理是鲁米诺和石墨相氮化碳纳米片之间的光电子转移。基于这一新发现,构建了以核酸适配体为识别单元的免标记通用型化学发光分析方法,成功用于疾病标志物癌胚抗原、腺苷和乙型肝炎病毒DNA的测定。DNA探针含有G-四链体序列,与血红素结合形成血红素/G-四链体DNA酶（hemin/G-quadruplex DNAzyme）,该酶能催化鲁米诺–过氧化氢反应产生化学发光。加入靶物后,由于靶物识别作用和DNA杂交作用,DNA发卡结构打开并与含有hemin/G-quadruplex DNAzyme的DNA探针形成稳定的双链DNA结构,因此不会吸附在石墨相氮化碳纳米片表面,从而阻断电子转移过程,使鲁米诺的化学发光显著增强。通过测定加入靶物前后化学发光信号的变化实现癌胚抗原的测定。化学发光强度的比值和癌胚抗原的浓度在0.1 ng/mL–150 ng/mL范围内呈现良好的线性关系,检测限为63 pg/mL。该方法不需要标记和修饰,具有简单、快速、成本低等优点,并为石墨相氮化碳纳米片在化学发光分析中的应用提供了新途径。（3）开发了简单、灵敏的hemin/G-quadruplex DNAzyme催化的化学发光能量转移体系用于肿瘤标志物miRNA-141的测定。本研究以鲁米诺为供体,氧化石墨烯（GO）和荧光染料为双受体,DNA探针G1由四分之三的G-quadruplex序列和二分之一的靶物识别序列组成,DNA探针G2包括四分之一的G-quadruplex序列和二分之一的靶物识别序列。G1和G2分别修饰荧光染料,与hemin作用后形成催化作用较弱的hemin/G-quadruplex DNAzyme,因其吸附在GO上导致化学发光信号十分微弱。加入miRNA-141后,其与探针杂交形成稳定且催化能力强的双链hemin/G-quadruplex DNAzyme结构,因不会吸附在GO表面使能量转移效率降低,从而显著增强鲁米诺的化学发光信号。通过该体系化学发光信号的增强实现了miRNA-141的灵敏检测。结果表明,化学发光强度的比值和miRNA-141的浓度在0.01 nM–200 nM范围内呈现良好的线性关系,检测限为4.7 pM。通过选择不同的DNA探针,该方法可以拓展到其他核酸的分析。综上所述,本文利用氧化石墨烯制备了长时间化学发光功能化纳米复合材料,并基于石墨相氮化碳纳米片和氧化石墨烯开发了化学发光生物分析新方法,成功用于蛋白质、核酸及生物小分子的分析检测。这些方法具有普适性,通过替换相应探针,便能实现其他靶物的检测。本研究为二维类石墨烯在化学发光分析中提供新的应用途径,也有助于扩大化学发光的应用范畴。