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嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)是生物冶金中的重要菌种,它的活性受到环境因素如温度、pH值的影响。它的最佳生长温度为30℃,但在浸矿堆中,温度普遍高于35℃,过高的温度抑制了A.ferrooxidans菌的活性,影响了生物浸出的速率。因此,开展A.ferrooxidans菌的抗热性研究具有重要意义。
本研究中,我们克隆了A.ferrooxidans菌的热激蛋白的groEL和groES基因,并最终在E.coli中表达,用一步亲和层析法纯化出浓度和纯度都较高的GroEL和GroES蛋白。用SDS-PAGE分析两种蛋白的分子量分别是57kDa和10kDa。在20-70℃范围内,测定了GroEL蛋白的ATP酶活性,50℃左右时活性最高,且其活性是温度依赖性的。GroES在20-50℃时严重抑制了GroEL的ATP酶活性,但在50℃后对GroEL的ATP酶活性无影响。测定了GroEL的分子伴侣活性,在温度较高时,它能使变性的A.ferrooxidons菌的铜蓝蛋白恢复活性。突变分析证明,Leu31是GroEL结合ATP的重要位点。序列比对和分子模拟表明,Y199、S201、Y203、F204 L234、L237、L259、V263、V264九个残基是其结合底物多肽的关键位点,这9个残基分别构成H-螺旋,I-螺旋和一段长环结构。H-螺旋,I-螺旋以及它们之间的沟槽构成了多肽结合的位点。微量热分析表明,正协同效应使GroEL快速结合并水解ATP,相对于Mg2+,Ni2+增强了GroEL的正协同效应。