烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)是一种被广泛研究的模式病毒,同时它也是一种感染性强、对农业生产危害很大的植物病毒。如何有效防治烟草花叶病毒的侵害是农药研发领域中的一个热点课题,具有重要的理论和现实意义。安托芬(Antofine)具有显著的抑制烟草花叶病毒的活性,并且这类天然产物具有潜在的细胞毒性和抗癌活性。因此我们选择Antofine和TMV作为本论文的研究体系,以Antofine作为生物活性探针分子,在TMV体系中进行详细的化学生物学研究,希望能够找到Antofine这类天然产物发挥生物活性的作用靶标,揭示其抑制烟草花叶病毒的机理。 Antofine是一个含有芳香环的近似平面分子。这种结构特征的分子易于与核酸形成嵌插式的非共价相互作用,因而我们猜测核酸很可能成为Antofine的生物靶标分子。为了考察Antofine识别核酸的特异性,我们首先设计并合成了具有不同二级结构特征的DNA分子,包括单链、双链和发夹结构,其中发夹结构包括环和茎部含有不同数目的凸起碱基。通过荧光光谱、紫外光谱等方法,研究了Antofine与这些不同二级结构DNA的相互作用,较系统地阐述了Antofine与核酸作用的规律,发现Antofine更倾向于识别核酸双链区域的凸起结构,尤其是发夹结构的单碱基凸起,并且能够稳定其二级结构。这些结论对于研究小分子识别非正常碱基配对的核酸结构具有学术价值,同时对于深入理解Antofine及其类似物生物活性的作用机制和方式,促进新的抗癌、抗病毒靶标的发现具有现实意义。 对Antofine生物靶标的认知,为我们探索Antofine抗烟草花叶病毒的机制提供了理论基础和重要线索,我们在TMV颗粒的组成物质中验证了这一结论,TMv RNA是Antofine可能的靶标分子。Antofine通过多位点结合方式以很高的亲和力与TMV RNA发生相互作用,并对其构象产生扰动。TMV RNA上组装起始位点的单碱基凸起发夹结构具有Antofine识别的优势特征结构,Antofine同样表现出对它很高的亲和力。TMV RNA不仅是病毒遗传信息的携带者,同时它折叠成特定的三维结构执行其生物功能,其中发夹、凸起、假结等丰富的二级结构为Antofine提供了多个可能的作用靶点。这些发现提示了Antofine可能的抗病毒途径,为深入研究Antofine抗烟草花叶病毒活性的机制提供了分子基础。组装起始位点是病毒组装过程中被壳蛋白首先识别的结构,并因此引发组装。该结构重要的生物学意义以及Antofine对它很强的亲和力启发我们:Antofine的抗病毒活性可能来源于对RNA的识别作用阻碍了病毒组装。实验证实,Antofine有效地抑制了绝大部分TMV RNA与壳蛋白起始组装的成核反应,并且进一步阻碍了那些已经成核的颗粒延伸为具有感染性的完整病毒颗粒。病毒RNA是Antofine作用的靶标,而组装抑制能力可能是两种作用模型的协同贡献：稳定局部RNA二级结构并阻碍其熔链的结扣模型,嵌插于组装前沿瞬时变构形成的三核苷酸爪形结合口袋的楔子模型。基于本文的实验结果和分析讨论,我们提出Antofine抑制烟草花叶病毒的可能机理:Antofine与TMV RNA发生强相互作用,通过结扣模型或楔子模型的方式,干扰壳蛋白对RNA的识别,阻碍病毒组装起始、延伸而形成具有感染性的全长颗粒,从而抑制病毒活性。我们的研究不仅第一次对Antofine抗TMV的机制进行了阐释,发现了第一个与基因组RNA相互作用产生病毒组装抑制作用的小分子,更重要的是提供了一种小分子靶向RNA抑制病毒组装的抗病毒新思路和新途径,为设计RNA特异性结合的抗病毒抑制剂提供基础。RNA的凸起-发夹结构是许多病毒组装起始信号,因而这里提出的抗病毒新策略具有发展前景和普适意义。 Antofine抑制病毒组装起始反应,对于TMV总体组装抑制具有非常重要的作用,因此我们希望更深入认识壳蛋白以及Antofine识别组装起始位点的序列或结构选择性。利用SELEX技术,我们对含有～109种不同序列的起始位点随机文库进行系统筛选,获得了具有组装起始能力的突变体。通过对突变体活性和序列的分析鉴定,我们发现：茎环的顶部都具有"NNG"的特征序列,并且N均为A或U;具有两个NNG重复的序列能很好起始组装,并且NNG并不一定出现在与野生型序列相同的相位上。Antofine对RNA的组装抑制能力不是序列特异的,而是与序列自身的组装起始能力相关。这提示,Antofine与壳蛋白的作用靶标可能是具有相同特征的核酸构象,而NNG形成的爪形结构可能就是这样的特征构象。该结论为我们所推测的Antofine抑制作用的楔子模型提供了辅证。我们的工作加深了对病毒组装起始机制的认识,也进一步理解了Antofine抑制病毒组装的机理。另一方面,我们筛选到比野生型组装能力更强的OriRNA突变体,它们有可能通过生物工程应用于烟草的细胞,通过与壳蛋白的竞争性组装实现抗病毒作用,我们的工作为抗病毒研究提供了更丰富的信息和新的思路。 病毒防治是医药和农药研发领域中急需解决的课题。本文通过研究具有显著抗病毒活性的天然产物Antofine对模式病毒TMV的病毒抑制机理,揭示Antofine生物活性的作用靶标,为理解这类天然产物在生物体内的作用机制提供了分子基础；阐释抑制烟草花叶病毒的机理,为开发新型的抗病毒药物提供了有价值的理论指导。