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研究目的宫颈癌是世界范围内高发的肿瘤,尤其是在发展中国家,宫颈癌的发病率和死亡率分别位居于女性恶性肿瘤的第二位和第三位。放射治疗是目前宫颈癌最有效的治疗手段之一,大部分宫颈癌患者对放射线较为敏感,但仍有部分病人对放射线耐受,放疗后容易复发及远处转移,预后很差。因此探索与宫颈癌放射敏感性相关的可调控的分子靶点依然是亟待解决的难题。非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)通路是哺乳动物DNA双链断裂的最主要修复通路,也是肿瘤细胞逃避放射线杀伤的主要机制。最近,一项研究发现NHEJ通路相关长链非编码RNA(LncRNA in non-homologous end joining pathway 1,LINP1)高表达可导致三阴性乳腺癌对放化疗产生抵抗。然而,LINP1在其他肿瘤中的表达情况和生物学功能尚不明确。本研究旨在检测LINP1在宫颈癌中的表达水平,并进一步探讨其介导宫颈癌放射抵抗的功能及机制。实验方法1.实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测宫颈癌组织和细胞中LINP1的表达量;2.RNA 免疫共沉淀(RNA-immunoprecipitation,RIP)和 RNA-pulldown 实验检测LINP1与DNA-PKcs、Ku80的相互作用;3.RNA 荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术观察LINP1的亚细胞定位;4.蛋白免疫印迹(Western blot)检测Caspase3剪切体和PARP剪切体的表达量;5.免疫荧光染色(Immunofluoresence staining)检测细胞核内y-H2AX焦、点形成;6.流式细胞术(Flowcytometry)检测细胞凋亡情况;7.克隆形成实验(Colony formation assay)分析LINP1对宫颈癌细胞放射敏感性的影响。实验结果1.LINP1在宫颈癌组织和细胞株中均有表达。5例宫颈癌患者中有3例癌组织中LINP1的表达量显著高于癌旁组织,而在4株宫颈癌细胞系中,Hela S3表达较高水平的LINP1。2.在宫颈癌细胞系中检测到LINP1与DNA-PKcs、Ku80存在相互作用。3.放射线照射可以诱导LINP1亚细胞定位的改变。RNA荧光原位杂交实验表明,在未受放射线照射的情况下,LINP1主要定位在细胞质中,而在放射线的作用下可向细胞核内转移。4.干扰LINP1可促进放射诱导的细胞凋亡。流式细胞分析术结果显示,与单纯放疗组相比,LINP1敲减加放疗组的凋亡率明显增加,其差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白免疫印迹实验结果提示,LINP1低表达的细胞接受放射线照射后,cleaved-Caspase3和cleaved-PARP蛋白表达水平明显上升。5.干扰LINP1可增强宫颈癌细胞的放射敏感性。免疫荧光染色结果显示,放射线处理24小时后,LINP1敲低组细胞核内γ-H2AX焦点的数量与对照组相比明显增加(P<0.05)。体外克隆形成实验结果表明,用不同的shRNA序列干扰LINP1对Hela S3细胞具有放射增敏作用,其放射增敏比(sensitizing enhancement ratio,SER)分别为1.44和1.37。以上结果提示LINP1能够促进DNA双链断裂的修复过程,降低放射治疗的效果。结论LINP1可以通过NHEJ通路协助宫颈癌细胞修复DNA双链断裂损伤,是一个潜在的预测放射治疗敏感性的分子标志物和临床治疗靶点。