背景与目的：乳腺癌(breast cancer)是女性常见的恶性肿瘤。在西欧和北美高发区,是严重威胁妇女健康的常见病和多发病。进入21世纪,全世界每年约有120万妇女患乳腺癌,50万人死于乳腺癌。美国为乳腺癌的高发国家,乳腺癌的发病率呈明显的上升趋势,1973-1976年美国每年估计有10万人患乳腺癌,每年有3万人死于该病；1990年全年约有15万新发病例,有4.4万人死亡,依据发病率变化趋势估计,21世纪美国将每8名妇女中就有1人一生中将患乳腺癌。我国为乳腺癌的低发国,但近年来的临床观察提示,我国乳腺癌发病率在不断的上升,每年约增长3%,在京、津、沪等大中城市,乳腺癌已跃居女性恶性肿瘤之首年龄有明显的提前趋势,且我国临床诊断的乳腺癌病期偏晚。为此,乳腺癌的研究日益引起人们的关注。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤细胞内存在一群具有干细胞性质的细胞(称肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞,cancer stem cells or cancer initiating cells, CSCs or CICs),不受外界调控的恶性增殖、多向分化,从而形成肿瘤。越来越多的研究证实在脑胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤等实体瘤中存在肿瘤干细胞。Hedgehog家族成员包括SHH、PTCH、GIi-1和SMOH。Hedgehog信号通路激活的具体机制目前尚不完全清楚,多数学者认为主要包括配体依赖的激活和配体非依赖的激活。配体依赖的激活是指配体如SHH、IHH(Indian Hedgehog)与受体PTCH结合,诱导原癌基因Smo的激活,引起Hedgehog信号通路的激活,这已在小细胞肺癌、肝癌、乳腺癌、脑恶性肿瘤和消化道癌中得到证实；配体非依赖的激活主要指信号通路成员如PTCH或SMOH突变所启动的Hedgehog信号通路的激活,这已经在Gorlin-相关肿瘤(如基底细胞癌和横纹肌肉瘤等)中得到证实。GIi-1基因的高表达是Hedgehog信号通路活化目前比较公认的标志之一。多项研究证实Hedgehog信号通路在多发骨髓瘤、乳腺癌和恶性胶质瘤等的干细胞中高表达,并在其自我更新中起重要作用。敲除SHH信号可导致小鼠神经干祖细胞明显减少,在体外培养几乎不能形成神经球；相反,激活SHH途径,使成年小鼠终脑的干祖细胞数量明显增加。IHH突变可减少肠道干细胞的增殖和分化。细胞角蛋白(cytokeratin, CK)是分布于上皮细胞的中间纤维丝主要表达于上皮细胞,在人类上皮组织中共发现至少20个成员,其表达具有很强的组织特异性和分化特异性。每种上皮组织在生长分化的不同阶段都表达不同的CK,其表达受细胞分化调节,如腺上皮主要表达I型CK(包括CK7, CK8, CK18, CK19, CK20),而鳞状上皮主要表达Ⅱ型CK(包括CK1, CK5/6, CK14)。因此,对不同CK的定位研究和观察不同状态下CK的表达,对了解上皮细胞的增殖和分化状态以及疾病的发生和发展有一定的意义。研究提示,CK5是基层的标志角蛋白,在乳腺普通增生细胞中,CK5常阳性,而在多数浸润性导管癌及导管原位癌中,CK5常阴性,所以CK5常作为浸润性和导管原位癌与普通型增生鉴别的依据之一。CK8是单纯上皮的标志角蛋白,它能够穿透乳腺癌细胞的外表面,并以一种可溶的杂多聚体的形式从癌细胞中释放出来,CK8存在于许多单纯上皮细胞和癌中,也用于乳腺癌的鉴别诊断。乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)是一个位于细胞膜上的ABC半转运蛋白,有研究提示它可能是乳腺上皮组织低分化的标志,在异常增生的组织中BCRP高表达,是细胞未分化成熟的表现BCRP的存在可能与肿瘤细胞耐药并引起肿瘤复发和治疗失败有关。本课题以乳腺癌细胞系MCF-7和人乳腺癌组织为研究对象,通过体外培养、分选乳腺癌干细胞,并采用实时定量PCR技术及免疫组织化学方法分别检测Hedghehog通路在MCF-7细胞系CD44+/CD24-/low干细胞亚群中的表达情况以及Hedghehog通路的重要蛋白,细胞角蛋白在人乳腺癌组织中的表达情况。分析它们与不同乳腺病变之间可能存在的相关性,探讨乳腺癌的发生机制,将为乳腺癌的早期诊断、预后评价和基因治疗指标的筛选提供有价值的实验依据。材料与方法：乳腺癌细胞系MCF-7和人乳腺病变组织均选自大连医科大学中日临床病理中心,2004-2009年人乳腺组织标本164例,其中正常乳腺组织23例、乳腺增生组织16例、乳腺纤维腺瘤组织26例、导管上皮非典型增生12例、导管原位癌6例和浸润性导管癌81例。患者年龄28-75岁,平均年龄45岁。所收集的标本均为手术切除送检标本,术前均未接受放化疗治疗,术后获得明确病理诊断并得到患者及其家属的知情同意。所有切片均经2位高年资病理医师复诊,其中正常乳腺组织为13例癌旁乳腺组织,距肿瘤5cm。本研究采用免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、实时定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR)和细胞培养、磁珠分选等方法,检测Hedgehog通路在MCF-7细胞系CD44+／CD24-／low干细胞亚群中的表达情况,Hedghehog通路的重要蛋白,细胞角蛋白在人乳腺癌组织中的表达情况和分布特点。实验数据采用SPSS 11.5软件包,应用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney的检验方法,对各因子在不同乳腺病变组织中的分布进行统计学差异分析。应用Spearmen相关性检验判断相关因素之间的统计学关系结果：一、乳腺癌细胞系MCF-7中CD44+／CD24-／low亚群比例为(8.90+1.73)%。乳腺癌细胞系MCF-7的CD44+／CD24-／low亚群中Hedgehog信号通路处于明显活化状态,其中Hedgehog信号通路中重要下游信号分子GIi-1在MCF-7细胞系CD44+／CD24-／low细胞亚群中的表达要明显高于非CD44+／CD24-／low细胞亚群(P为0.007)。二、PATH 1和Gli-1在正常乳腺组织、乳腺瘤组织、及乳腺癌中的阳性表达率呈现逐渐升高的趋势,PATH1表达率分别为10.0%,46.1%和96.2%,Gli-1表达率分别为20.0%,69.2%和98.1%。随着乳腺病变组织分化程度的下降,PATH1和Gli-1的阳性表达率明显增加,呈强阳性表达。浸润性导管癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织,乳腺癌组织中的表达明显高于乳腺瘤组织(P<0.05)。三、CK5和CK8在正常乳腺组织、乳腺增生、非典型增生及乳腺癌中的阳性表达率依次下降。CK5在正常乳腺组织、乳腺增生、导管上皮非典型增生、导管原位癌和浸润性导管癌组织的阳性表达率分别为84.6%,62.5%,41.7%,33.3%,19.0%。CK8在正常乳腺组织、乳腺增生、导管上皮非典型增生、导管原位癌和浸润性导管癌组织的阳性表达率分别为100.0%,100.0%,75%,66.7%,66.7%。绝大部分浸润性导管癌呈现CK5-/CK8+,28例(66.7%),只有8例(16.7%)呈现CK5+／CK8-,8例呈现CK5+／CK8+,14例(29.2%)呈现CK5-／CK8-。随着乳腺病变组织分化程度的下降,BCRP的阳性表达率明显增加,在正常乳腺组织、乳腺增生、导管上皮非典型增生、导管原位癌和浸润性导管癌组织的阳性表达率分别为15.4%,250%,25%,33.3%,42.9%。浸润性导管癌组织中的表达明显高于正常乳腺组织,乳腺癌组织中的表达明显高于乳腺增生组织(P<0.05)。结论：一、乳腺癌细胞系MCF-7中存在CD44+／CD24-／low干细胞标志细胞亚群,其中Hedgehog信号通路处于明显活化状态。二、PATH1和Gli-1在乳腺不同病变组织中的表达和分布存在差异,分化程度越低表达越强。三、不同分化程度的乳腺导管癌中CK5和CK8的表达不同,分化程度越高CK8的表达越弱、CK5的表达相对较强,分化程度越低CK8的表达越强、CK5的表达相对较弱甚至缺失。BCRP在乳腺不同病变组织中的表达和分布存在差异,提示BCRP可能在乳腺肿瘤细胞分化方面有一定的作用。CK5.CK8和BCRP在不同乳腺病变组织中的相关性,三者联合检测有助于乳腺病变的病理学诊断和判断其分化程度及预后。综上所述,免疫磁珠法分选乳腺癌干细胞是一种简便可靠的方法,分选得到的CD44+／CD24-／low干细胞标志细胞亚群中,Hedgehog信号通路处于明显活化状态。几种肿瘤干细胞标志物可用于乳腺病变的病理学诊断。