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目的:观察由饥饿诱导的增生性瘢痕成纤维细胞自噬发生,并探讨其发生机制及意义,为研究增生性瘢痕的形成机制与自噬之间的关系提供实验基础,并进一步为其临床防治提供新的治疗靶点。
方法:
1.增生性瘢痕的取材及细胞培养手术中切取人增生性瘢痕组织9例,取自创面愈合后12个月以内的增生性瘢痕,色泽红、质硬、高出皮肤表面,局部无感染和溃疡,且均未曾治疗,患者知情同意,无肿瘤、结缔组织疾病等。采用组织块培养法原代培养增生性瘢痕成纤维细胞,实验用第3~7代细胞。
2.细胞处理及分组取对数期增生性瘢痕成纤维细胞,接种于6孔细胞培养板,用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养24h后,用EBSS(Earles balanced salt)代替培养液,分别饥饿处理1h、2h、3h。对照组继续用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。
3.Western blot和荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组成纤维细胞微管相关蛋白1轻链(LC3)和自噬相关蛋白Beclin-i的蛋白及基因表达。
4.单丹磺酰戊二胺(MDC)染色和透射电镜观察成纤维细胞内自噬体结构。
结果:
1.Western blot检测LC3和Beclin-1的蛋白表达与对照组相比,饥饿处理1h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1/GAPDH增高,饥饿2h组达高峰,3h组则呈下降趋势,与对照组相比差异有统计学意义;Beclin-1在饥饿处理1h后表达增高,2h达到高峰后逐渐下降,与对照组相比差异有统计学意义。
2.荧光定量RT-PCR检测LC3和Beclin-1的mRNA表达实验发现,LC3 mRNA表达在饥饿处理1h后即有增高,2h达到达到高峰,3h下降,与对照组相比差异有统计学意义; Beclin-1 mRNA在饥饿处理1h后表达增高,2h达到高峰后3h逐渐下降,与对照组相比差异有有统计学意义。
3.MDC荧光染色观察MDC荧光染料作为自噬泡的示踪剂,在荧光显微镜下呈蓝绿色点状结构,多分布于核周。对照组细胞中可见少量的点状结构;而饥饿处理2h后,MDC阳性细胞数明显增多。计算对照组饥饿2h组的自噬细胞百分率分别为3.4±1.4、65.7±7.4。两组比较差异有统计学意义。
4.透射电镜观察细胞超微结构透射电镜下,对照组细胞细胞核较大,核仁明显,胞浆内清晰可见线粒体、内质网。而饥饿处理2h后细胞胞浆内可见大量囊泡状结构,在高倍电镜下可见双层膜结构,包含未消化的胞浆成分及碎裂的细胞器。
结论:通过蛋白和基因水平的检测,以及染色和细胞超微结构的观察表明饥饿可以诱导增生性瘢痕成纤维细胞发生自噬。自噬可能通过调节细胞内蛋白代谢影响增生性瘢痕的形成。