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佐剂作为一种免疫增强剂,广泛应用于多种疫苗,而新型佐剂的不断涌现也极大地推动了疫苗的研发进程。尽管使用佐剂的历史已持续了近百年,然而其作用机制仍未得以完全阐明,这也为疫苗设计中合理选择佐剂带来了困扰。近年来药物安全性评价技术有了巨大的发展和突破,但是对免疫系统安全性评价研究仍缺乏准确、灵敏、有效的手段。基因芯片技术作为比较成熟的技术手段,在其他多种学科中应用广泛,将其用于免疫系统安全性评价具有一定的基础,是未来免疫毒理学发展的一个重要方向。本研究选择具有传统经典佐剂铝佐剂和三种具有代表性的新型疫苗佐剂,使用基因芯片技术探究佐剂对免疫系统相关基因表达谱的影响,并结合免疫器官、免疫细胞、免疫分子、整体免疫功能等多个指标,系统性地对机体免疫状态进行全面评价。同时,选择不同类型佐剂联合相同抗原进行全面系统的免疫功能相关临床前安全性评价,研究和阐明不同佐剂的作用机理,为疫苗设计和研发中合理选择佐剂提供理论依据。1.研究方法：不同佐剂对免疫系统的作用：雌性BALB/c小鼠,8-10周龄,分别单次肌肉注射PBS、不同剂量铝佐剂(10,50,200mg/kg)和MF59 (0.5,2.5, 10ml/kg),于给药后1h、3h、6h和24h解剖并采血,对免疫相关脏器称重并进行组织病理学检查；同时进行T细胞依赖性抗体反应(T cell dependent antibody response, TDAR)检测、淋巴细胞亚群表型分析、外周血细胞因子检测、小鼠脾脏基因表达谱分析等。不同佐剂结合同种抗原对免疫系统的作用：雌性BALB/c小鼠,8-10周龄,分别单次肌肉注射PBS、H5N1灭活病毒(4μgHA)、H5N1(4μg HA)+不同剂量铝佐剂(10,50mg/kg)、H5N1 (4μg HA)+MF59 (0.5,2.5ml/kg)、H5N1 (4μg HA)+Poly (I:C) (0.25,10mg/kg)和H5N1 (4μg HA)+CpG-ODN (0.1,5.0 mg/kg),于给药后1h、3h、6h和24h解剖并采血,对免疫相关脏器称重并进行组织病理学检查；运用红细胞凝集抑制试验(hemagglutination inhibition test, HI)方法,检测小鼠机体中H5N1抗体表达水平；同时进行脾脏细胞亚群表型分析、外周血细胞因子检测、小鼠脾脏基因表达谱分析等。2.研究结果：不同佐剂对免疫系统的作用：铝佐剂和MF59相对脏器系数均无显著性变化,组织病理学检查发现,给药后6h MF59高剂量组脾脏偶见生发中心易染体巨噬细胞数目增多,但病变程度轻且发病率低。TDAR检测结果显示,铝佐剂对机体抗KLH特异性IgG抗体水平无显著性影响,MF59则提高了机体抗KLH特异性kG抗体水平。铝佐剂对于小鼠脾细胞中CD69、CD86和CDllc的阳性细胞比例的作用不显著,MF59中高剂量在给药后1h和3h,三种分子的阳性细胞比例都有不同程度的降低。铝佐剂对各细胞因子水平无显著性影响,MF59能不同程度促进Th2型细胞因子和趋化因子分泌。铝佐剂和MF59引起的脾脏基因变化与自身的生理变化类似,铝佐剂对小鼠脾脏几乎无免疫刺激作用,MF59上调与细胞因子分泌、免疫反应相关介质调节和白细胞迁移等相关基因,促进免疫细胞向局部注射部位募集,但变化的差异基因数目较少。不同佐剂结合同种抗原对免疫系统的作用：给药后24h, Poly(I:C)和CpG-ODN脾脏重量显著增加,其余组别无显著性改变。组织病理学检查发现,H5N1灭活病毒和各联合佐剂组脾脏可见不同程度白髓易染体巨噬细胞数目增多。m抗体滴度检测显示,铝佐剂、MF59和低剂量CpG-ODN有提高H5N1抗体表达水平的趋势,MF59作用最强,Poly(I:C)阳高剂量CpG-ODN则有降低H5N1抗体表达水平的趋势。给药后24h,单独抗原组以及佐剂联合抗原组均能上调小鼠脾脏CD86和CD69阳性细胞比例。铝佐剂、MF59和Poly (I:C)联合H5N1均能促进Th2型细胞因子和趋化因子分泌,而对促炎性细胞因子以及Thl型细胞因子无显著性作用,且MF59的促进作用更强,而Poly (I:C)与H5N1联合后对细胞因子分泌的促进作用比单独使用佐剂时减弱；CpG-ODN联合H5N1对于趋化因子、Thl型细胞因子和Th2型细胞因子均有促进分泌作用。四种佐剂与H5N1联合均能上调脾脏固有免疫应答、防御病毒反应等相关功能基因,但铝佐剂和MF59差异表达基因数目较单独抗原组减少,Poly(I:C)和CpG-ODN差异表达基因数目比单独抗原组显著增多,且Poly (I:C)差异表达基因涉及自身免疫病相关通路。3.结论：铝佐剂、MF59、Poly(I:C)和CpG-ODN均能增强机体免疫反应。小鼠脾脏全基因表达谱分析结果与组织病理学检查、免疫细胞亚群分析、细胞因子检测、TDAR检测等结果较为一致,与铝佐剂和MF59相比,Poly (I:C)和CpG-ODN能够激活机体细胞免疫反应且作用更为强烈。四种不同类型佐剂与H5N1抗原联合使用：铝佐剂和MF59能够更好地激活体液免疫应答；CpG-ODN能够同时增强Thl型和Th2型免疫应答；从细胞因子分泌和抗体表达水平的角度来看,Poly (I:C)对H5N1抗原免疫效果的提升作用不显著。