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本研究首次使用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)表达梅毒螺旋体(Tep onema pallidum)47 kDa、17 kDa和15 kDa三个内膜脂蛋白。毕赤酵母具有很多真核表达系统的优点,例如蛋白质的加工、折叠和转录后修饰,分泌表达,以及很强的甲醇诱导启动子等。 以梅毒螺旋体标准菌株Nichols基因组DNA为模板,扩增出47 kDa、17 kDa和15 kDa 3个成熟蛋白基因(不包含N端信号肽序列),PCR产物经酶切后分别与pPICZB和pPIC9K两个质粒相连,再转化进毕赤酵母菌株GS115。pPICZB和pPIC9K质粒不具备酵母复制起始位点,因此重组质粒通过同源序列与宿主菌株基因组重组,形成了稳定遗传的重组蛋白表达菌株BTP47-GS115、BTP17-GS115、BTP15-GS115和KTP47-GS115、KTP17-GS115、KTP15-GS115。 BTP47-GS115、BTP17-GS115和BTP15-GS115菌株经过诱导,收集菌体并用超声波破碎,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,确定目的蛋白在胞内形成了表达。进一步诱导表达,用Ni-NTA纯化,分别得到了His-BTP15:4.8mg/L、His-BTP17:6.6 mg/L和His-BTP47:25 mg/L的融合蛋白,ELISA鉴定均具有抗原活性。 KTP47-GS115、KTP17-GS115和KTP15-GS115菌株经过诱导,亦通过SDS-PAGE和Western blot鉴定培养上清,确定目的蛋白形成了较高量的分泌表达。其中KTP47和KTP17表达量在200mg/L培养液以上,KTP15也达到了100mg/L培养液左右,具备了大规模生产的潜力。 同时,以纯化的His-BTP47抗原免疫BALB/c小鼠,拟建立梅毒螺旋体47 kDa抗原杂交瘤细胞株。以KTP47抗原包被96孔板,建立了间接ELISA梅毒血清检测系统,用于免疫小鼠效价测定和杂交瘤细胞株的筛选。最后我们筛选出了3株能稳定分泌47 kDa抗原特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株,命名为B2H2、C3F5