论文部分内容阅读
[目的]
采用骨组织形态计量学、生物力学和对骨矿物质含量及其有关生化指标检测等方法观察不同剂量仙珍骨宝对去卵巢大鼠骨代谢和生物力学的影响，并与己烯雌酚的作用比较，探讨仙珍骨宝预防去卵巢骨质疏松的作用机制，为仙珍骨宝在绝经后骨质疏松(PMOP)防治的临床开发应用提供理论和实验依据。
[方法]
60只3月龄清洁级SD雌性大鼠，随机分成6组，1组为假手术(SHAM)组，灌胃自来水5ml/kg/d，连续90天；2组为去卵巢(OVX)组，灌胃自来水5ml/kg/d，连续90天；3组为去卵巢加已烯雌酚(OVX+DES)组，灌胃己烯雌酚5ml/kg/d，连续90天。4、5、6组分别为去卵巢加低、中、高剂量仙珍骨宝组，分别灌胃25％、50％、100％仙珍骨宝水提液(5ml/kg/d)，连续90天。所有大鼠被处死前13、14天皮下注射25mg/kg盐酸四环素一次，于被处死前3、4天皮下注射钙黄绿素5mg/kg各一次，两荧光标记间隔10天。实验结束后，大鼠腹腔注射3％戊巴比妥钠(1.5ml/kg)麻醉，心脏取血处死大鼠，收集血液进行骨转化血生化指标检测；取左侧胫骨、第4腰椎行不脱钙骨包埋、制片和染色，通过半自动图像分析系统进行骨组织形态计量学检测；用858Mini Bionix型材料测试系统分析右侧股骨(三点弯曲试验)的生物力学性能；取右侧尺骨用盐酸溶解后测定其骨羟脯氨酸(HYP)和骨矿物元素的含量。
[结果]
1.去卵巢大鼠骨质疏松的特点
1.1体重以及内脏器官重量的改变：与SHAM组比较，OVX组大鼠体重增加了23.6％(P<0.05)、胸腺体重比增加了80.9％(P<0.05)、子宫体重比减少了77.2％(P<0.05)，肝脏、肾脏和肾上腺体重比变化无统计学意义。
1.2血生化的改变：与SHAM组比较，OVX组白介素6(IL-6)血清浓度减少22％(P>0.05)，碱性磷酸酶(ALP)血清浓度增加了39.5％(P>0.05)，抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)浓度减少了6.3％(P>0.05)。
1.3血清微量元素改变特点：与SHAM组比较，OVX组的血清钙(Ca)浓度增加了3.4％(P>0.05)，血清铁(Fe)浓度减少了30.0％(P>0.05)，血清磷(P)减少了21.0％(P>0.05)。
1.4有机物质HYP与骨矿元素含量的改变：与SHAM组比较，OVX组大鼠HYP与骨矿元素含量变化无统计学意义(P>0.05)。
1.5骨形态计量学变化特点：
1.5.1腰椎松质骨：与SHAM组比较，OVX组大鼠腰椎松质骨的骨小梁面积百分率(％Tb.Ar)、骨小梁数量(Tb.N)分别减少了36.9％和32.4％(P<0.05)；而骨小梁分离度(Tb.Sp)、单位骨小梁周长破骨细胞数(Oc.N)、破骨细胞周长百分数(％Oc.Pm)分别增加了76.8％、66.1％、166.7％(P<0.05)；荧光周长百分数(％L.Pm)、骨形成率指标(BFR/BS、BFR/BV)分别增加了183.5％、187％、220.1％，差异显著，有统计学意义(P<0.05)。
1.5.2胫骨上段松质骨：与SHAM组比较，OVX组大鼠胫骨上段松质骨％Tb.Ar、Tb.N分别减少了76.5％、76.7％(P<0.05)；Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm分别增加了474.8％、373.3％、93.80％(P<0.05)；％L.Pm、BFR/BS、BFR/TV分别增加了25.9％、30.5％、29％(P<0.05)。
1.6股骨骨生物力学的改变：与SHAM组比较，OVX组股骨生物力学最大载荷下降10.5％(P<0.05)，股骨刚性系数减少无统计学意义。
2.己烯雌酚对去卵巢大鼠骨质疏松的影响
2.1体重以及内脏器官重量的改变：与OVX组比较，OVX+DES组大鼠体重显著减少、胸腺体重比明显减少、子宫体重比明显增加，差异显著，有统计学意义(P<0.05)。
2.2血生化的改变：与OVX组比较，OVX+DES组大鼠IL-6血清浓度增加了42.9％，ALP血清浓度减少了23.7％，StrACP浓度增加了14.0％，差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.3有机物质HYP与骨矿元素含量的改变：与OVX组比较，OVX+DES组大鼠HYP含量增加了95.8％(P>0.05)；骨Ca、骨Fe、骨Zn分别增加了190％、650％、660％(P<0.05)，骨Mg、骨P变化差异无统计学意义。
2.4骨形态计量学表现特点
2.4.1腰椎松质骨：与OVX组比较，OVX+DES组大鼠腰椎松质骨的％Tb.Ar、Tb.N分别增加了30.5％、19.5％(P<0.05)，而Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm分别降少了26.2％、37.4％、58.8％(P<0.05)；％L.Pm、BFR/BS、BFR/BV分别减少了77.1％、77.2％、74.2％(P<0.05)。
2.4.2胫骨上段松质骨：与OVX组比较，OVX+DES组大鼠胫骨上段松质骨的％Tb.Ar、Tb.N分别增加了231.2％、253.6％，Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm分别减少了77.8％、48.5％、38.9％(P<0.05)；％L.Pm、BFR/BS、BFR/BV均减少，但是差异无统计学意义(P>0.05)。
2.5股骨骨生物力学的改变：与OVX组比较，OVX+DES组股骨刚性系数增加了18.6％，最大载荷增加了10.4％，差异均无统计学意义(P>0.05)。
3.仙珍骨宝对去卵巢大鼠骨质疏松的影响
3.1体重以及内脏器官重量的改变：(1)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组体重明显增加(P<0.05)、OVX+仙高组体重增加无统计学意义；(2)与SHAM组比较，OVX+仙中组肝脏体重比明显降低(P<0.05)；(3)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组子宫体重比均明显减少(P<0.05)；(4)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组肾上腺重量差异无统计学意义(P>0.05)；(5)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组体重减少分别为6.2％、4.8％、10.4％，差异无统计学意义(P>0.05)；(6)与OVX组比较，OVX+仙低组胸腺体重比明显减低(P<0.05)，OVX+仙中组和OVX+仙高组胸腺体重比减少不明显(P>0.05)；(7)与OVX+DES组比较，OVX+仙低组肾上腺体重比明显减少(P<0.05)；(8)仙珍骨宝三个剂量组之间比较，各内脏器官体重比变化无统计学意义。
3.2血生化的改变：(1)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组IL-6血清浓度均有所增加，但无统计学意义(P>0.05)；(2)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组ALP血清浓度均减少，但无统计学意义(P>0.05)；(3)与OVX组比较，OVX+仙低组ALP血清浓度显著降低(P<0.05)；(4)与OVX+DES组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组ALP分别下降9.3％，2.1％(P>0.05)，OVX+仙高组ALP增加2.6％(P>0.05)；(5)仙珍骨宝三个剂量组之间比较，各内脏器官重量变化无统计学意义。
3.3血清元素改变特点：(1)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组血清Ca浓度无明显变化(P>0.05)；(2)与SHAM组比较，OVX+仙低组血清Mg浓度显著减少(P<0.05)；(3)与OVX+仙低组比较，OVX+仙中组Mg浓度显著增加(P<0.05)；仙珍骨宝三个剂量组之间比较，各血清元素浓度变化无统计学意义。
3.4有机物质HYP与骨矿元素含量的改变：(1)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组尺骨HYP含量分别增加了125.7％、119.4％、83.27％，差异均无统计学意义(P>0.05)；与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组尺骨HYP含量分别明显增加了74.3％，70.2％，42.2％，差异均无统计学意义(P>0.05)；(2)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组骨钙分别增加了58.9％(P>0.05)，190.3％(P<0.05)，124.4％(P<0.05)；与OVX组比较，OVX+仙中组、OVX+仙高组骨钙含量显著增加(P<0.05)；(3)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组骨铁含量分别增加了250％(P>0.05)，500％(P<0.05)，650％(P<0.05)；(4)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组骨镁含量分别增加了34.6％(P>0.05)，84.6％(P<0.05)，61.5％(P<0.05)；(5)与SHAM组比较，OVX+仙低组骨磷含量明显增加(P<0.05)；与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组骨磷含量分别增加了13.7％，45.1％，21.6％，均无统计学意义(P>0.05)；(6)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组骨锌含量分别增加了480％(P>0.05)，860％(P<0.05)，660％(P<0.05)；(7)与OVX+DES组比较，OVX+仙低组骨钙、骨铁含量显著减少(P<0.05)，OVX+仙中组、OVX+仙高组HYP和各矿物质含量变化均无统计学意义；(8)仙珍骨宝三个剂量组之间比较，与OVX+仙中组比较，OVX+仙高组HYP和骨钙含量分别减少16.5％，22.7％(P>0.05)；与OVX+仙低组比较，OVX+仙中组骨钙、铁、镁、磷、锌分别增加了82.7％、71.4％、37.1％、27.6％、65.5％。由此可见，对于提高尺骨有机质与骨矿物质含量疗效比较，仙珍骨宝中剂量组>仙珍骨宝高剂量组>仙珍骨宝低剂量组，且中剂量组在此效果和阳性对照DES组相当。
3.5骨形态计量学表现特点
3.5.1腰椎松质骨：(1)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组三组大鼠腰椎松质骨的％Tb.Ar、Tb.Th差异均无显著意义，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组Tb.N分别增加了3.0％、15.4％、2.3％；OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组Tb.Sp分别减少了7.2％(P>0.05)、17.1％(P>0.05)、5.8％(P>0.05)；OVX+仙低组Oc.N显著减少35.4％(P<0.05)，OVX+仙高组Oc.N显著减少38.1％(P<0.05)；OVX+仙高组％Oc.Pm显著减少61.2％(P<0.05)；(2)而与OVX+DES组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组各项静态参数均无显著差异(P>0.05)；(3)与OVX组比较，OVX+仙低组％L.Pm明显减少(P<0.05)，BFR/BS明显减少(P<0.05)，BFR/BV减少52.6％，但差异无统计学意义(P>0.05)；与OVX组比较，OVX+仙中组％L.Pm明显减少(P<0.05)，BFR/BS、BFR/BV减少但差异无统计学意义(P>0.05)；与OVX组比较，OVX+仙高组％L.Pm明显减少(P<0.05)，BFR/BS明显减少(P<0.05)，BFR/BV减少54.8％，但差异无统计学意义(P>0.05)；(7)与OVX+DES组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组各动静态参数变化均无统计学意义；(8)仙珍骨宝三个剂量组之间比较，OVX+仙高组Tb.Sp比OVX+仙中组增加13.6％(P>0.05)，OVX+仙高组％Tb.Ar、MAR、BFR/BS、BFR/BV比OVX+仙中组分别减少了6.7％、13.7％、13.4％、12.0％(P>0.05)。提示不同剂量仙珍骨宝组对于恢复腰椎松质骨量疗效为中剂量组大于高、低剂量组。
3.5.2胫骨上段松质骨：(1)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组％Tb.Ar、Tb.N均显著降低(P<0.05)；(2)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组Tb.Sp、Oc.N、％Oc.Pm均减少，但无统计学意义(P>0.05)；(3)而与OVX+DES组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组各项静态参数均无显著差异；(4)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组％L.Pm、BFR/BS、BFR/BV均减少(P>0.05)，OVX+仙高组％L.Pm、BFR/BV显著减少(P<0.05)；(5)与OVX+仙低组比较，OVX+仙高组骨形成指标均BFR/BS、BFR/BV显著增加(P<0.05)。(7)与OVX+DES组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组各动静态参数变化均无统计学意义；(8)仙珍骨宝三个剂量组之间比较，OVX+仙高组％Tb.Ar、Tb.N比OVX+仙中组分别减少38.1％、39.3％(P>0.05)，OVX+仙高组Tb.Sp比OVX+仙中组分别增加了70.1％(P>0.05)；OVX+仙高组MAR、BFR/BS、BFR/BV比OVX+仙中组均不同程度增加(P>0.05)，但综合骨形成与骨吸收指标，对于恢复去卵巢大鼠胫骨上段松质骨骨量疗效，仙珍骨宝中剂量组>仙珍骨宝高剂量组>仙珍骨宝低剂量组。
3.6股骨骨生物力学的改变：(1)与SHAM组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组股骨刚性系数均增加(P>0.05)，OVX+仙低组最大载荷减少了10.5％(P>0.05)；(2)与OVX组比较，OVX+仙低组、OVX+仙中组、OVX+仙高组股骨刚性系数分别增加了17.7％(P>0.05)、17.7％(P>0.05)、32.6％(P<0.05)，股骨最大载荷分别增加了2.5％(P>0.05)、10.2％(P>0.05)、8.4％(P>0.05)；(2)与OVX+DES组，OVX+仙低组最大载荷数下降7.9％(P>0.05)；OVX+仙中组、OVX+仙高组股骨刚性系数和股骨最大载荷变化均无统计学意义；(3)三个剂量组之间比较，OVX+仙中组、OVX+仙高组最大载荷数比OVX+仙低组分别增加了7.8％、6.7％。对股骨生物力学的作用可见，仙珍骨宝中、高剂量组疗效高于仙珍骨宝低剂量组。
[结论]
1雌性大鼠去卵巢后呈现高转换型骨质疏松，其特点是：雌性大鼠去卵巢后体重增加，子宫体重比以及胸腺体重比减轻，与绝经期后妇女的临床表现相似；胫骨上段和腰椎的松质骨均发生骨量减少，骨的三维结构变差，胫骨上段骨形成率和骨转换率增高；股骨的骨生物力学性能下降，骨质量明显变差。
2己烯雌酚可以预防去卵巢大鼠的骨丢失，对大鼠不同部位的骨骼的作用不同，对去卵巢胫骨上段松质骨的作用最明显，对腰椎松质骨的作用较小，同时具有刺激肝脏、胸腺、子宫、肾上腺等内脏器官的不良反应。
3各个剂量组的仙珍骨宝对于去卵巢致大鼠骨质疏松症均有一定的防治作用。仙珍骨宝可以抑制去卵巢大鼠体重增加，而对子宫、肾上腺等内脏器官无明显刺激。仙珍骨宝使去卵巢大鼠HYP和骨矿物质含量明显增加。仙珍骨宝作用于去卵巢致骨质疏松大鼠不同部位骨骼的松质骨显微结构变化特点如下：胫骨上段和腰椎的松质骨骨量均有一定增加，未完全达到SHAM组水平，骨吸收减少，骨的高转化率降低，骨生物力学性能增加。
不同剂量组的仙珍骨宝对于去卵巢致大鼠骨质疏松症防治作用程度有所不同。根据上述结果，去卵巢大鼠中剂量仙珍骨宝组HYP、骨Ca、骨P、骨量增加最多，且结合附图1和附图2，可见去卵巢大鼠腰椎和胫骨上段骨小梁以仙珍骨宝中剂量组增多最显著，可推测中剂量仙珍骨宝对于防治去卵巢致大鼠骨质疏松症效果最佳。