肉鸡在集约化养殖模式下存在一系列免疫和应激问题,尤其在肉鸡养殖前期,各种疫病的发生率高且危害大,这与肉鸡年龄阶段性的免疫功能特性有关。基于此,我们针对性的选取黄芪多糖(Astragalus Polysacchirides,APS)作为免疫营养调控因子,结合营养表观遗传调控策略,利用APS改变父母代种公鸡肠道中的免疫微环境,经长期刺激后研究其免疫相关传代性调控效应及其营养表观遗传调控机制,并分析APS在体外试验中的免疫调节作用及相关信号通路因子,探讨采用APS诱导的父系传代免疫调控效应应对肉鸡前期免疫性能低下问题的可行性。试验一、种公鸡胸腺免疫的年龄阶段差异性本试验采用单因素试验设计,120只1日龄科宝500种公鸡,分为15笼饲喂,每笼8只鸡,用以分析种公鸡胸腺免疫性能的年龄阶段差异性。在2周龄(雏鸡)和40周龄(成年鸡),每笼选取一只接近平均体重的种公鸡进行屠宰试验,采集胸腺样品进行表型分析和转录组测序分析,并对核心调控因子的启动子甲基化修饰进行检验,以解释胸腺免疫功能的年龄阶段差异性及其维持机制。试验结果显示:成年鸡的胸腺质量和形态与雏鸡存在显著差异(P≤0.05);鉴于这种表型差异性,本试验采用RNA-seq方法分析了胸腺中基因在转录水平的基因表达状况,用以确定年龄相关免疫功能差异的分子调控机理,Pearson相关性分析和主成分分析结果均显示成年鸡和雏鸡胸腺中基因在转录组水平的基因表达模式存在显著差异,雏鸡和成年鸡间有1949个差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs,其中成年鸡胸腺中有1822个高表达基因,127个低表达基因)。基于DEGs的GO和KEGG功能富集性分析结果筛选获得4个免疫相关显著富集性KEGG信号通路,分别为细胞因子-细胞因子受体互作通路、肠道Ig A合成免疫调控网络、Toll样受体信号通路和糖尿病并发症相关通路,这就说明肉鸡胸腺免疫功能,包括抗原识别、炎症反应及肠道黏膜免疫等均具有发育阶段差异性。与这4条免疫相关信号通路相关的差异表达基因在雏鸡组均显示低表达(P≤0.05)特性,说明2-W雏鸡胸腺中4条免疫相关信号通路均呈现低活性状态。肉鸡胸腺免疫的年龄阶段性差异可维持较长时间,DNA甲基化修饰可满足这一基因表达调控特性,所以我们检验了CD40启动子甲基化修饰状况,CD40与4条免疫信号通路的3条具有高相关性,且与胸腺免疫功能调控紧密相关,且雏鸡胸腺中的CD40启动子甲基化修饰水平极显著(P≤0.01)高于成年鸡,这与基因的表达差异性一致,维持基因在雏鸡阶段的低表达特性和相关通路的低活性。本试验说明肉鸡胸腺免疫功能具有年龄阶段差异性,相比于成年鸡,雏鸡的胸腺免疫处于一种低活性状态,此调控效应与雏鸡胸腺中CD40启动子高甲基化相关的基因表达抑制存在一定相关性。试验二、饲粮添加黄芪多糖对种公鸡免疫性能的影响肉鸡发育前期胸腺TLR信号通路保持低活性状态,影响其免疫功能状态,而APS可适度激活TLR4信号通路,优化机体免疫活性状态,本试验拟探索种公鸡长期摄入APS对其免疫和生产性能的影响。我们检测了饲粮长期(40周)添加APS对种公鸡体重、肠道黏膜组织形态、血清细胞因子、肠道黏膜及脾脏免疫的影响。本试验采用单因素试验设计,160只科宝500种公鸡随机分为5组,在其玉米-豆粕型基础饲粮中分别饲喂0、0.01、0.10、1.00和10.00 g/kg APS,每个处理4重复,每个重复8只鸡,将种公鸡饲喂至44周龄,称量种公鸡体重并采集血清样品,左侧颈静脉放血屠宰后采集各小肠肠段、小肠黏膜和脾脏样品进行试验分析。我们之前的试验发现由于种公鸡饲养过程中需要严格限饲,饲粮中添加APS对种公鸡体重并无显著影响,但饲粮添加10.00 g/kg APS可显著改善种公鸡肠道黏膜组织形态(后续分子指标分析选取10.00g/kg APS处理组),肠道黏膜更新需依赖于APS的免疫刺激作用。所以,本试验首先采用抑菌环和梯度稀释法试检验了APS的直接抑菌效应,试验结果显示APS并无直接抑菌效应,APS免疫调节作用更多源自于其对免疫系统的直接影响,进而我们分析了APS对肠道黏膜和脾脏免疫的影响。试验结果发现种公鸡饲粮添加10.00 g/kg APS对空肠黏膜中TLR4信号通路、细胞因子、内毒素耐受及肠道组织形态相关基因的表达均无显著影响;血清中细胞因子IFN-α、IFN-β和IL-4浓度亦无显著差异性;种公鸡脾脏中,饲粮添加APS对TLR4相关基因的转录亦无系统性影响。总之,种公鸡饲粮中添加10.00 g/kg APS可显著改善其肠道黏膜组织形态,但源于种公鸡免疫系统对饲粮中长期(44周)添加APS的适应性,APS对种公鸡空肠黏膜及脾脏免疫功能均无显著影响。试验三、种公鸡饲粮添加黄芪多糖对商品代肉鸡免疫的影响由于种公鸡免疫系统对APS长期刺激的适应性,种公鸡日粮添加APS对其本身肠道黏膜和脾脏免疫并无显著影响,本试验旨在探讨种公鸡饲粮添加APS对商品代肉鸡生长状况和免疫性能的传代调控作用。本研究采用单因素试验设计,在基础日粮中分别添加0、0.01、0.10、1.00和10.00 g/kg APS,每个处理4重复,每个重复8只鸡,将种公鸡饲喂至40周龄后每个重复选取一只高繁种公鸡采集精液,并分别为每个重复对应的12只种母鸡输精,在5天里连续3次输精后采集种蛋,每个重复选取重量在65到70 g之间的受精蛋20枚用于孵化试验以获得商品代肉仔鸡,每个重复获得16只商品代肉鸡,商品代肉鸡根据种公鸡处理进行分组,商品代肉鸡饲喂商品颗粒料,不额外添加APS,自由饮水,饲喂于环控仓中且不进行疫苗免疫,商品代肉鸡饲喂至2周龄(采集每天体重数据)时左侧颈静脉放血屠宰后采集血清、小肠肠段、小肠黏膜和脾脏样品。本研究结果发现,种公鸡饲粮添加10.00 g/kg APS可传代性的改善商品代肉鸡养殖前期的体重和空肠黏膜组织形态,基于此表型差异性,选取10.00 g/kg APS处理组进行进一步的分子检验;种公鸡饲粮APS可诱导商品代肉鸡空肠黏膜免疫系统TLR4信号通路产生内毒素耐受样反应状态,APS对TLR4表达无影响,TLR4信号通路下游TRIF通路激活而My D88信号通路保持相对静息状态,NF-κB表达显著(P≤0.05)提高,种公鸡饲粮添加APS显著(P≤0.05)提高了IFN-α和IFN-β的表达,趋势性(0.05≤P≤0.1)提高了IL-4和IL-6的表达,并显著(P≤0.05)提高了IL-4上游调控因子GATA3的表达,内毒素耐受调控因子SOCS1的表达极显著(P≤0.01)升高,IFN-α下游的STAT1表达显著(P≤0.05)升高,总之,种公鸡饲粮添加10.00g/kg APS可通过活化TLR4下游的TRIF通过,并活化IFN-α/β及其下游的内毒素耐受因子SOCS1,诱导商品代肉鸡空肠黏膜免疫系统TLR4信号通路的内毒素耐受样免疫反应;肠道黏膜免疫活性可通过血液循环系统影响系统免疫活性,种公鸡饲粮添加10.00 g/kg APS可显著(P≤0.05)提高商品代肉鸡血清I类干扰素(IFN-α和IFN-β)水平;进一步分析APS对脾脏免疫的父系传代调控作用,与肠道黏膜免疫系统类型,种公鸡饲粮APS可影响商品代肉鸡脾脏中的TLR4信号通路活性,诱导内毒素耐受样免疫反应,其下游通路My D88通路抑制,而TRIF通路被激活,种公鸡饲粮中添加APS对商品代肉鸡脾脏中细胞因子的表达亦有显著影响,可显著(P≤0.05)提高TNF-α和IL-6的表达,并可显著(P≤0.05)提高IL-4及其上游调控因子GATA3的表达,但促炎细胞因子和内毒素耐受调控因子的表达均无显著变化。总之,本试验说明种公鸡饲粮中长期添加高剂量APS可诱导商品代肉鸡空肠黏膜和脾脏免疫的TLR4信号通路内毒素耐受免疫反应,并可通过其免疫调控效应改善商品代肉鸡的肠道黏膜组织形态和生长状况。试验四、黄芪多糖对肠上皮细胞TLR4信号通路活性的影响TLR信号通路是最重要的免疫识别信号通路,基于试验一,我们发现雏鸡胸腺TLR4信号通路处于抑制状态,所以本论文拟采用APS针对性的适度激活TLR4通路,来改善肉鸡免疫性能。试验二、三结果发现APS可通过父系传代调控作用改善商品代肉鸡的肠道黏膜免疫性能,进而通过血液循环系统影响脾脏免疫功能。本试验选用Caco2细胞作为肠道上皮细胞模型,并构建LPS内毒素耐受免疫模型,结合LPS炎症反应模型,探讨APS对肠道上皮细胞免疫状态的影响,并通过RNA干扰在转录水平抑制TRIF通路活性,分析APS免疫反应类型及其相关信号通路调控因子。试验第一部分采用单因素随机试验设计,分为5组,对照组(C),APS处理组(APS,1mg/m L),LPS处理组(LPS,1 ug/m L),APS+LPS组(AL)及LPS内毒素耐受组(ET),每个处理3个重复。采用q RT-PCR和流式细胞分析方法分别在转录和翻译水平检验TLR4信号通路、细胞因子及内毒素耐受调控因子相关基因的表达状况,并采用ELISA试剂盒检验Caco2细胞IL-1、IL-8及TNF-α的合成和分泌活性。试验结果显示LPS刺激可诱导TLR4-My D88相关炎性细胞毒性反应,活化TLR4信号通路,并显著(P≤0.05)提高促炎细胞因子的表达,促进(P≤0.05)IL-8的合成和分泌活性,而APS可抑制LPS诱导的炎症反应,显著(P≤0.05)降低IL-8的合成和分泌,产生类似于内毒素耐受反应的基因表达特性。第二部分试验采用2×3拉丁方试验设计,两个处理因素分别为TRIF干扰和APS及LPS处理,分别为(对照组、TRIF干扰组)×(对照组、LPS处理组、APS+LPS处理组),分别为对照组(Control)、LPS处理组(LPS)、APS+LPS处理组(AL)以及TRIF干扰组对应的对照组(s-Control)、LPS处理组(s-LPS)和APS+LPS处理组(s-AL),每个处理设置3个重复。分析TRIF抑制状况下APS和LPS刺激对Caco2细胞的调控效应,试验结果显示TRIF敲除后,APS不能有效抑制LPS诱导的炎症反应,TLR信号通路活性及促炎细胞因子的表达均表现出与LPS处理组高度的一致性,促炎细胞因子IL-8仍保持较高的合成和分泌活性。综上,在Caco2细胞模型中,APS可TRIF依赖性的抑制LPS诱导的炎性细胞毒性反应,并显著抑制LPS诱导的促炎细胞因子高表达,进一步可确定APS可影响肠道黏膜免疫系统的活性状态,从侧面验证说明APS的父系传代调控效应是源于其对肠道黏膜免疫的影响。试验五、黄芪多糖父系传代性调控效应中的表观遗传修饰作用本试验采集APS父系传代试验中对照组和10.00 g/kg APS处理组种公鸡空肠黏膜、脾脏及精液样品,和商品代肉鸡空肠黏膜和脾脏样品,并检验其关键调控因子My D88、TRIF和SOCS1的启动子甲基化和组蛋白修饰状况,用以探讨APS以精子为媒介的营养表观遗传修饰作用。试验结果显示就DNA甲基化修饰而言,种公鸡饲粮APS可显著(P≤0.05)降低种公鸡空肠黏膜和精子中的的SOCS1启动子甲基化修饰水平,商品代肉鸡空肠黏膜中的SOCS1启动子甲基化也有一定程度的降低,且SOCS1启动子Cp G富集区段为转录激活因子结合区,APS诱导的低甲基化有利于促进SOCS1的表达,且精子中SOCS1启动子的低甲基化可作为传代调控因子参与APS的父系传代调控效应;APS对My D88、TRIF及脾脏中SOCS1的启动子甲基化修饰并无显著影响,只有组织特异性的低甲基化修饰;种公鸡饲粮中的APS可显著(P≤0.05)影响空肠黏膜和脾脏中My D88和TRIF基因启动子区段的组蛋白修饰(脾脏SOCS1启动子Dimethyl-H3K9修饰亦有显著提高),诱导符合基因表达特性的组蛋白修饰类型。另外,种公鸡饲粮添加APS可显著提高(P≤0.05)精子中My D88的Dimethyl-H3K9修饰水平,并可显著(P≤0.05)降低精子中TRIF的Dimethyl-H3K9修饰水平。总之,在APS诱导的内毒素耐受样父系传代调控过程中,DNA甲基化(空肠黏膜SOCS1)和组蛋白修饰(My D88和TRIF)发挥重要调节作用。试验结论:肉鸡雏鸡阶段的系统免疫活性处于相对抑制状态,而APS可诱导TLR4-TRIF通路相关内毒素耐受样免疫反应,可针对性改善肉雏鸡免疫性能,通过种公鸡饲粮添加APS可通过父系营养表观遗传机制传代诱导商品代肉鸡肠道黏膜免疫系统TLR4信号通路的内毒素耐受免疫反应,并影响外周免疫器官脾脏的免疫状态,进而可优化肉仔鸡前期的肠道形态和生长状况,在肉仔鸡获得期望性状。总之,APS通过父系营养表观遗传机制改善商品代肉鸡免疫和体增重是一种应对肉鸡雏鸡阶段免疫抑制问题的可行性策略。