目的:　　 胃癌(Gastric Cancer)是我国常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康。近年来,胃癌患者的整体疗效虽然有所提高,但这主要得益于以早期发现、早期诊断、早期治疗为主的胃癌“三早”工作的不断开展。目前,中晚期胃癌在住院患者中仍占有较大比例,相当一部分患者在确诊时已失去手术时机,综合治疗后5年生存率始终徘徊在30％～40％。根治术后复发和转移是影响胃癌预后的主要原因。因此,深入研究胃癌的发病机制、发展过程和有效地综合治疗靶点是进一步提高胃癌综合治疗疗效的关键。　　 已有研究认为,胃癌的发生和发展是一个多基因、多步骤参与的过程。包括癌基因的激活、抑癌基因的失活等等。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,一系列与胃癌发生、发展关系密切的基因被发现,并得到深入研究和认识。然而,已有的研究结果仍然不能解释胃癌所有的发生事件,说明还有其它参与其中的基因或机制未得到认识。　　 人类Runt相关转录因子3(Human Runt-Related Transcription Factor3,RUNX3)是Runt家族中新近认识,并为广泛关注的一个基因,是哺乳动物Runt家族进化的基础。RUNX3基因编码α、β两个亚单位,形成异源二聚体,构成RUNX3蛋白。α亚单位含有一个128个氨基酸的高度保守的Runt域,位于氨基末端,形成一个S形免疫球蛋白折叠。α亚单位需要与β亚单位形成二聚体后才能识别同源的DNA结合序列以介导蛋白质之间的相互作用。RUNX3蛋白的羧基末端在转录调节中起作用。研究发现,敲出RUNX3基因的小鼠胃粘膜上皮细胞由于过度增殖和凋亡抑制而出现异型增生,并且对TGF-β诱导的生长抑制和凋亡失敏感。人胃癌细胞系在裸鼠的致癌性与RUNX3的表达水平负相关。说明,RUNX3在正常胃粘膜中发挥着重要的生理作用,是胃上皮的主要生长调控因子。RUNX3在胃癌中的失活可能抑制胃粘膜上皮凋亡、促进增生和转移,是胃癌的重要的致癌因素。　　 目前,关于RUNX3与胃癌的关系研究较少。因此,本研究旨在考察RUNX3在胃癌组织中的表达情况及其与胃癌临床病理学特点的关系;研究RUNX3表达变化的分子机制;探讨其表达变化与胃癌细胞增殖、粘附及侵袭的关系。　　 方法:　　 一、RUNX3基因在人胃癌组织中表达及其与胃癌临床病理特点的关系　　 采用实时定量PCR法检测52例胃癌组织及癌旁5cm以外经病理学证实的非癌组织RUNX3表达情况,并与临床病理学指标比较;　　 采用免疫组化法检测103例胃癌组织及癌旁5cm以外经病理学证实的非癌组织RUNX3表达情况,并与临床病理学指标比较。　　 二、胃癌RUNX3基因启动子高甲基化及其临床意义的研究　　 采用MSP技术检测52例胃癌及癌旁5cm以外经病理学证实的非癌组织中RUNX3基因启动子区CpG岛高甲基化状况,并分析其与胃癌临床病理参数之间的关系。　　 三、RUNX3基因低表达与胃癌细胞增殖、粘附、侵袭关系的研究　　 利用实时定量PCR技术分别检测SGC-7901、BGC-823、MGC-803、MKN-1胃癌细胞系中RUNX3表达情况,筛选表达水平最低细胞系作为进一步研究对象;　　 利用分子克隆方法构建RUNX3逆转录病毒载体,并进行酶切及测序鉴定;　　 利用逆转录病毒载体将RUNX3转染人胃癌SGC-7901细胞,G418筛选获得稳定转染克隆进行鉴定;　　 采用软琼脂克隆形成实验检测上调RUNX3基因对SGC-7901细胞克隆形成能力的影响;　　 采用MTT法检测上调RUNX3基因对SGC-7901细胞增殖能力的影响;　　 采用Millicell小室法检测上调RUNX3基因对SGC-7901细胞迁徙能力的影响;　　 采用Transwell侵袭小室法检测上调RUNX3基因对SGC-7901细胞侵袭能力的影响。　　 结果:　　 一、RUNX3基因在人胃癌组织中表达及其与胃癌临床病理特点的关系　　 实时定量PCR检测RUNX3 mRNA表达水平显著低于其配对癌旁非癌胃粘膜组织(P=0.006)。52例胃癌组织中,46.2％(24/52)的病例RUNX3 mRNA表达水平低于癌旁非癌胃粘膜表达水平的2倍以上。RNUX3 mRNA低表达与性别(P=0.258)、年龄(P=0.779)、肿瘤大小(P=0.419)、肿瘤部位(P=1.000)、大体类型(P=0.199)、脉管癌栓(P=0.308)、分化程度(P=0.245)无关,而与浸润深度(P=0.048)、淋巴结转移(P=0.005)密切相关。　　 RUNX3蛋白主要在细胞核内表达,为核内棕黄或黄色颗粒。RUNX3在非癌胃粘膜中呈阳性或强阳性表达,在胃癌组织中呈阴性或弱阳性表达。103例胃癌组织中,RUNX3蛋白表达阳性率为50.5％(52/103)。103例配对癌旁非癌组织中,RUNX3蛋白表达阳性率为94.2％(97/103)。胃癌组织RUNX3蛋白表达阳性率显著低于配对癌旁非癌胃粘膜组织(P＜0.001)。RUNX3蛋白低表达与性别(P=0.091)、年龄(P=0.840)、肿瘤大小(P=0.845)、肿瘤部位(P=0.269)、脉管癌栓(P=0.486)、分化程度(P=0.407)、无关,而与大体类型(P=0.007)、浸润深度(P=0.003)、淋巴结转移(P=0.005)密切相关。　　 二、胃癌RUNX3基因启动子高甲基化及其临床意义的研究　　 MSP显示52例胃癌组织中,31例RUNX3基因启动子高甲基化,发生率为59.6％。52例癌旁正常胃粘膜组织中4例检测到RUNX3基因启动子高甲基化,发生率为7.7％。统计学检验提示,胃癌组织RUNX3基因启动子高甲基化的发生率显著高于相应的癌旁正常胃粘膜组织(P＜0.001)。　　 RUNX3启动子区高甲基化与RUNX3基因mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.777,P＜0.001)。　　 RUNX3基因启动子高甲基化与性别(P=0.146)、年龄(P=1.000)、肿瘤大小(P=0.270)、肿瘤部位(P=0.523)、分化程度(P=0.369)无关,而与大体类型(P=0.034)、脉管癌栓(P=0.034)、浸润深度(P=0.009)、淋巴结转移(P＜0.001)密切相关。　　 三、RUNX3基因低表达与胃癌细胞增殖、粘附、侵袭关系的研究　　 经实时定量PCR检测发现4种胃癌细胞系中RUNX3 mRNA表达均低于正常胃粘膜细胞系,其中SGC-7901细胞的RUNX3表达量最低。　　 重组质粒pLXSN-RUNX3被EcoRI和BamHI双酶切鉴定,分别形成5.9Kb及1.5Kb大小的DNA片段,与预计片段长度相同。测序结果与GeneBank公布的RUNX3cDNA序列比对可知,构建的pLXSN-RUNX3载体结构正确,RUNX3基因序列完整。　　 利用逆转录病毒载体将RUNX3转染进入胃癌细胞系SGC-7901,经G418筛选,获得了12个稳定转染RUNX3的细胞克隆和5个稳定转染空载体的细胞克隆。12个阳性克隆中,经实时定量PCR检测,发现5号、7号克隆细胞株分别较空载体对照细胞RUNX3表达量明显上调,该结果经Western-blot蛋白检测得到进一步证实。　　 MTT法检测发现SGC-7901细胞和SGC7901/pLXSN空载体细胞在24、48、72、96小时细胞生长速度基本一致。而SGC-7901/pLXSN-RUNX3-5和SGC-7901/pLXSN-RUNX3-7细胞在24d,时生长速度无显著降低,但48、72、96d,时细胞生长速度明显降低。　　 软琼脂克隆形成实验结果表明,5、7号克隆与SGC-7901细胞及空载体细胞对照组相比克隆形成数量明显减少。　　 Millicell小室法测定细胞迁徙能力发现,稳定上调RUNX3的SGC-7901/pLXSN-RUNX3-5和SGC-7901/pLXSN-RUNX3-7细胞与阴性对照SGC7901细胞及转染空载体SGC-7901/pLXSN细胞相比,迁徙能力被显著抑制。　　 Transwell侵袭小室法测定细胞侵袭能力发现,稳定上调RUNX3的SGC-7901/pLXSN-RUNX3-5和SGC-7901/pLXSN-RUNX3-7细胞与阴性对照SGC7901细胞及转染空载体SGC-7901/pLXSN细胞相比,侵袭能力被显著抑制。　　 结论:　　 RUNX3 mRNA及蛋白表达水平与胃癌的发生、发展及临床病理学参数密切相关,可作为胃癌诊断与治疗的分子靶点。　　 胃癌组织RUNX3基因启动子高甲基化的发生率显著高于相应的癌旁非癌胃粘膜组织,且与胃癌临床病理学特点密切相关。胃癌中RUNX3启动子区的高甲基化是导致其表达失活的主要机制。　　 RUNX3低表达与胃癌细胞增殖、迁徙和侵袭密切相关。重新表达RUNX3可以部分逆转肿瘤细胞的恶性表型。