活性海洋真菌的鉴定及其次级代谢产物的研究

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 8次 | 上传用户:jimmyreagan
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从福建沿海海滩采集的各种海洋生物样品中分离纯化得到218株海洋真菌,其中酵母菌有52株。经液体发酵后,分别通过半叶法和叶碟法进行海洋真菌发酵液抑制烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)侵染、抑制TMV增殖的活性筛选,通过MTT法进行发酵液抗肿瘤的活性筛选。结果表明,有39株海洋真菌的发酵液对TMV侵染的抑制率超过90%,6株海洋真菌的发酵液对TMV增殖的抑制作用较高,5株海洋真菌对两种肿瘤细胞的抑制活性均较好。进一步,对活性菌株进行了形态鉴定,并对其ITS rDNA序列进行了同源进化关系分析。结果表明,菌株1008F1 597kb的ITS rDNA序列与Neosartaya fischery(AF 176661)的ITS序列同源性高达100%,可鉴定为Neosartaya fischery.菌株1002F2575kb的ITS rDNA序列与Aspergillus sp.(EU159210、EU159210和EU159210)的ITS序列同源性高达100%,1009F1 609kb的ITS rDNA序列与Whalleya microplaca(EF026129)的ITS序列同源性高达98%,可鉴定为Whalleya microplaca.以7种植物病原真菌为供试菌种,对两株海洋真菌及其次级代谢产物的水溶性提取物进行抑菌试验。结果表明,菌株1002F2和菌株1009F1抑菌活性相对较高。其中,菌株1002F2水溶性提取物对高粱炭疽菌和番茄早疫菌的抑制活性较高,ECso值分别为1.34g/L和0.94g/L;菌株1009F1水溶性提取物对瓜果腐霉菌和番茄早疫菌的抑制活性较高,ECso值分别为0.63g/L和0.65g/L。对初筛得到的7株活性菌株的固体发酵产物粗提物进行抗TMV增殖活性的复筛,结果表明,菌株0312F1和1008F1的固体发酵产物活性仍然较高,从而将其确定为大量发酵的活性菌株。活性追踪的结果显示,菌株1008F1发酵产物甲醇提取物的活性部位在水溶性部分。采用柱层析(DCC)、薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)等分离手段,从菌株1008F1(Neosartaya fischery)的水溶性提取物中共分离到9个纯品化合物。经波谱学鉴定结构,其中2个为蒽醌类化合物,化合物2个为腺苷类化合物,3个为生物碱类化合物。分别利用叶碟法和MTT法进行了抗TMV增殖和抗肿瘤活性的测定,对活性较高的化合物进行了抑制中浓度(EC50)的测定。结果显示,在200μg/mL供试浓度下,化合物3、5和8抗TMV增殖活性较高,EC50分别为153.08μg/mL、83.80μg/mL和96.99μg/mL;化合物5对胃癌细胞和肝癌细胞的抑制活性均较高,EC50分别为91.15μg/mL和100.02μg/mL。在此基础上,对化合物抗病毒及抗肿瘤活性构效关系(Structure-activity relationship, SAR)进行了分析。结果表明,抗植物病毒是生物碱类化合物的又一新的生物活性。就化合物5-7而言,C-7位羟基的存在是化合物5和7具有较高活性的原因,同时,C-7和C-8位之间双键的存在可能是化合物6和7活性降低的原因。
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