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猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原,不仅能导致猪的脑膜炎和败血症等,还能引起人的脑膜炎和中毒性休克综合症等。猪链球菌常依其形态、生化特性、血清学特征来鉴定和分类,根据荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)抗原特性将猪链球菌分为33个血清型(1～31型,以及1/2和33型),另有部分未定型菌株存在。在世界不同地区,由猪链球菌引起的临床疾病的血清型也不同,主要为1、2、3、4、7、9型,其中,以2型为主。猪链球菌可寄生在健康猪群的扁桃体和上呼吸道,和发病猪成为该病主要的传染源。根据其致病性的差异,猪链球菌可分为强毒株、弱毒株和无毒株,现一般根据毒力因子的分布来判断菌株毒力,但目前还没有明确的鉴别方法,动物实验仍是检验菌株毒力强弱的现行方法。因此,本研究对广东地区的猪链球菌进行了流行病学调查,为研究猪链球菌致病机理提供一定依据。1.猪链球菌33个血清型单重PCR鉴定方法的确定及其主要致病血清型2、7、9型多重PCR检测方法的建立根据相关文献合成猪链球菌33个血清型的鉴定引物,用31个血清型标准菌株的基因组分别对33对引物进行特异性试验,通过对退火温度的摸索,成功确定无交叉反应的33个血清型单重PCR分型的方法程序(2型和1/2型,1型和14型暂不能通过PCR方法鉴别)。并构建19个血清型阳性对照质粒。根据广东地区猪链球菌的流行情况,成功建立了猪链球菌主要致病血清型2、7、9型多重PCR的检测方法。特异性、敏感性试验结果表明本研究建立的多重PCR检测方法特异性好、敏感性高(最低可达到104CFU/ml);准确性试验和重复性试验符合率均达100%。该方法成本低、效率高,适用于猪场链球菌病监控和流行病学快速诊断。2.广东地区猪链球菌的流行病学调查本研究采集了 488份健康猪鼻拭子和扁桃体样品,对其中360份健康猪样品进行检测,发现带菌率为39.72%,未断奶仔猪鼻拭子样品中阳性率最高(68.00%);从488份健康猪样品中共分离到68株SS,鉴定得到50株SS分布于16个血清型,包括16型(11.76%)、2型(8.82%)、29型(7.35%)等。另对实验室保存的58株来自发病猪分离的SS,经鉴定分离的40株SS共分布于10个血清型中,主要分布的血清型有3型(13.79%),7型和9型均占12.72%。结果表明,广州及周边地区SS广泛存在于猪群中,其血清型分布也较广(18个血清型);除2、7、9型外,3、16、19和29型在广东也比较流行。健康猪和发病猪流行的主要血清型不尽相同,证实了广州及周边地区SS流行的复杂性。3.猪链球菌分离株主要毒力因子的分布及2型分离株的特性分析PCR检测126株SS菌株中毒力相关基因mrp,epf,sly的分布。分离自健康猪的68株SS中,1株为mrp-/ef+/sly-/,6株mrp-/ef-/sly+/;病猪来源的58株SS中,mrp+/sly+/ef+和mrp-/sly+/ef+菌株各 2 株,16 株为mrp-/sly+/ef-,1株为mrp-sly-ef+。分离自病猪的2型菌株YN28和SS22,其PCR结果分别为mrp+/sly+/ef+、mrp-/sly+/ef+。以2型强毒株ZY05719和弱毒株T15分别为参考菌株(内标),通过斑马鱼模型评估YN28和SS22毒力水平,发现菌株按毒力强弱依次为ZY05719(1)>YN28(0.13)>T15(0)>SS22(-0.16)。生长特性分析结果显示,YN28 和 SS22分离株均在6 h进入稳定期,其对数生长期明显优先于参考菌株T15和ZY05719;稳定期后的最高OD600的值也低于参考菌株。