TF15调控胃癌的生物学行为和耐药的机制研究

来源 :内蒙古医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:asdf303
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目的:研究TF15在胃癌组织中的表达及其与患者预后的关系,观察敲低和过表达TF15对胃癌细胞增殖和迁移等恶性生物学行为的影响,确定其作为胃癌患者的特异性肿瘤分子标志物,并进一步探讨TF15与PI3K/AKT和TGFβ信号传导通路的关系。此外,筛选调控TF15的MicroRNA,分析与化疗耐药性的关系,并对接受化疗患者进行研究,探讨TF15在判断化疗预后方面的价值。  方法:第一部分,收集2005-2015年解放军总医院120例行胃癌根治术的组织标本,应用免疫组织化学检测TF15在胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达,并用Kaplan-Meier生存分析TF15与预后的关系;通过Western blot方法检测TF15在不同胃癌细胞中表达情况,筛选合适的细胞系作为过表达与敲低的细胞模型,采用CCK-8,平板克隆形成和划痕愈合实验检测敲低和过表达TF15对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。第二部分,利用免疫共沉淀技术和GST pull-down实验从体内外及生理条件下验证TF15与AKT1相互作用,并检测LY294002对其结合能力的影响;验证TF15与AKT1相互作用在各自结构域的具体区域定位及AKT1磷酸化位点的定位;筛选与TF15有相互作用的磷酸酯酶,并检测磷酸酯酶对TF15与AKT1相互作用的影响;确定TF15磷酸化修饰区域定位,筛选磷酸化修饰的位点,并检测位点对磷酸化修饰能力的影响;在过表达和敲低TF15的稳定细胞系中检测PI3K/AKT1信号通路与TF15互相作用的功能,其功能与两者相互作用的关系。第三部分,利用免疫共沉淀技术验证TF15与I型受体TβR-I的相互作用,检测SB431542对结合能力的影响;采用Western blot、RT-qPCR和免疫荧光染色检测过表达TF15稳定胃癌细胞系中上皮细胞间充质转化分子Marker表达水平的变化;RT-qPCR检测TGFβ对TF15和E-cadherin转录水平的影响。第四部分,通过Western blot技术检测顺铂和奥沙利铂对TF15蛋白表达水平影响,及过表达和敲低TF15表达与顺铂和奥沙利铂敏感性的关系;筛选调控TF15的microRNAs,并用RT-qPCR检测顺铂和奥沙利铂对microRNA表达水平的影响;收集接受化疗的胃癌组织标本,利用免疫组织化学染色检测TF15的表达,并分析其表达与胃癌患者预后的关系。  结果:1)TF15在胃癌组织比正常胃黏膜组织中的表达明显上调,TF15阳性表达的胃癌患者术后生存时间明显短于TF15阴性患者;TF15在不同胃癌细胞系及胃正常粘膜上皮细胞系中均有表达,成功构建慢病毒介导的敲低和过表达TF15胃癌细胞稳定克隆,过表达TF15促进胃癌细胞增殖和迁移,而敲低TF15抑制胃癌细胞增殖和迁移。2)TF15在体内外及生理条件下与AKT1存在相互作用,LY294002抑制TF15与AKT1的结合,TF15与AKT1的结合定位于TF15HD3结构域,在AKT1结构域上定位于PH结构域和催化结构域,具体定位在磷酸化Thr308位点;筛选与TF15存在相互作用的磷酸酯酶B55a,TF15与B55a竞争性结合AKT1;TF15磷酸化定位于TF15HD3结构域的Thr451位点,利用点突变方式突变Thr451位点,该位点抑制TF15磷酸化修饰的能力;结果表明过表达TF15升高P-AKT308的磷酸化水平,敲低则降低,LY294002抑制了过表达TF15的表达,并且还抑制了胃癌细胞的生长和迁移。3)TF15与I型受体TpR-I相互作用,定位于TF15HD3结构域,抑制剂SB431542不影响TF15与TβR-I受体的结合能力;TF15磷酸化自身不能结合形成复合物进入细胞核;过表达TF15细胞中Vimentin、N-cadherin、Twist1和slug表达水平上调,E-cadherin表达下调,TGFβ在转录水平上升高TF15的表达,降低E-cadherin的表达。4)顺铂和奥沙利铂诱导TF15蛋白表达水平,过表达TF15不改变铂类药物的敏感性,而敲低TF15敏感性显著增加,并且敏感性有时间和浓度效应;发现miR-1306-5p抑制TF15表达,铂类药物浓度与miR-1306-5p的表达负相关;接受铂类药物化疗TF15阴性表达的胃癌患者术后生存时间明显长于阳性表达患者,可以作为判断化疗耐药预后的独立因子。  结论:1.TF15在胃组织有表达,且胃癌组织表达明显高于正常黏膜组织,其中阴性表达患者的术后生存时间明显高于阳性表达;TF15还能促进胃癌细胞增殖和迁移,可以作为胃癌的特异性肿瘤分子标志物。2.TF15与AKT1存在相互作用,结合定位于TF15HD3结构域和AKT1Thr308位点,并且与磷酸酯酶B55a竞争性结合AKT1;TF15具有磷酸化修饰,其磷酸化定位于TF15HD3结构域的Thr451;PI3K/AKT1信号通路调控TF15功能依赖于两者的相互作用。3.TF15与I型受体TpR-I存在相互作用,结合定位TF15HD3结构域;TF15磷酸化自身不能结合形成复合物;TF15调节EMT Marker表达,而TGFβ影响TF15和E-cadherin转录水平。4.铂类药物诱导TF15表达,而TF15能调节铂类药物敏感性,并且有时间和浓度的效应;TF15是miR-1306-5p直接靶基因,miR-1306-5p/TF15轴调控铂类药物耐药,可以作为判断胃癌患者预后的指标。
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