目的:细胞器之间的相互作用一直是生命科学领域研究的前沿和热点。真核细胞内膜系统来源的内体系统和自噬在维持细胞稳态过程中发挥重要作用,并且它们之间的相互作用逐渐引起研究者重视。明确的是,肿瘤细胞在发生发展中需要不断的适应来自细胞内外恶劣的环境,这其中内体系统和自噬与转录水平应激发挥着重要的作用。内体系统中的早期内体在转运必需内体分选复合物（endosomal complexes required for transport,ESCRT）等作用下成熟为内含管腔内囊泡（intraluminal vesicles,ILVs）的多囊泡小体（multivesicular bodies,MVBs）,其不仅可以与溶酶体融合参与物质的降解与循环,还可以与细胞膜融合释放细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）,进而在各种病理生理进程中发挥重要作用。内体系统和自噬之间的相互作用在肿瘤细胞应激中发挥关键作用。一直以来,研究者认为内体系统和自噬的交互过程体现在自噬小体与MVB融合形成杂交过渡状态的自噬内涵体（amphisome）,并且其最终与溶酶体融合完成底物的彻底降解。然而最近研究揭示,amphisome的另一种重要命运是与细胞膜融合分泌外泌体,其包含来源于自噬小体的活性内容物,在病理生理过程中有重要的意义。显然,对amphisome生成和分泌机制的探究可以更加清楚的揭示内体系统和自噬之间相互作用的机制,进一步完善我们对细胞器之间的相互作用以及肿瘤应激情况下存活机制的认知。压力应激情况下,肿瘤细胞会启动转录水平应激参与细胞稳态的调控。NF-κB信号通路在转录水平应激中发挥关键作用,其与包括炎症和肿瘤等疾病的发生发展密切相关。当肿瘤应激状态时IKK复合物以依赖和不依赖NF-κB功能的方式,在多方面充当自噬重要的诱导剂,参与了对肿瘤细胞自噬活性的调控,增加其对恶性环境的抵抗能力进而确保肿瘤细胞的“安全”。IKKβ是IKK复合物中重要的催化亚基,具有调控NF-κB入核功能,而且其激酶活性可以使突触小体相关蛋白质（synaptosome-associated protein 23,SNAP23）和 β-catenin 等蛋白磷酸化,通过非NF-κB依赖性机制调节炎症、凋亡、自噬、细胞增殖和代谢。但IKK复合物激活是否诱导amphisome生成和sEVs分泌,以及可能的机制尚且未见报道。因此,本研究构建持续激活的IKKβ（CA-IKKβ）细胞系（HeLa、Huh7）用于探究肿瘤细胞内可能存在的内体系统与自噬之间的交流以及它们之间相互作用的机制。通过荧光共聚焦、透射和免疫电镜、纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）、囊泡分离和多克隆抗体合成等实验与技术进一步明确以IKKβ激活为促发点的肿瘤细胞内细胞器之间的相互作用机制,以及真核细胞内膜系统与NF-κB转录应激之间的关系,试图揭示肿瘤细胞在应激状态下可能的存活适应机制。研究方法:1、采用蛋白质免疫印迹（western blotting）验证IKKβ激活情况,通过超速离心分离条件培养基中的 sEVs 后,western blotting 检测 sEVs Marker（CD63、TSG101和CD81）;透射和免疫电子显微镜分析sEVs的结构;通过NTA分析条件培养基sEVs的数量和直径分布情况。2、免疫荧光共聚焦实验分析IKKβ激活的肿瘤细胞早期内体和MVB,超速离心分离培养基中的sEVs后,western blotting检测sEVs中泛素化蛋白（ubiquitinated proteins）含量。3、通过western blotting检测对照组（Ctrl）、野生组（WT）和突变激活组（CA）以及联合不同药物处理后肿瘤细胞中LC3和p62表达情况,判断IKKβ活性对自噬流的调控,免疫荧光共聚焦实验探究CA-IKKβ后自噬小体（标记物LC3）与溶酶体（标记物LAMPI）的共定位情况。构建stubRFP-sensGFP-LC3稳定细胞系,荧光共聚焦实验分析持续激活IKKβ肿瘤细胞自噬流情况。4、免疫荧光共聚焦检测自噬小体（标记物LC3）与MVB（标记物CD63）共定位情况,探究amphisome性状。透射电镜分析WT和CA组细胞中自噬小体,MVB和amphisome的形态与比例。ImageJ统计各自的直径和单位面积的数目。5、免疫电镜分析CA肿瘤细胞中胶体金标记的LC3和CD63分布情况。Western blotting检测IKKβ激活细胞分泌sEVs中自噬相关成分LC3和p62的表达。免疫电镜检测sEVs中LC3的情况。Western blotting检测Ctrl、WT和CA组以及联合不同药物处理后肿瘤细胞分泌的sEVs中LC3和p62表达情况,判断amphisome分泌情况。Western blotting 检测稳定敲减 ATG7 后 Ctrl、WT 和 CA 组 ATG7、LC3 和 p62表达情况,以及肿瘤细胞分泌的sEVs中LC3和p62表达情况。6、Western blotting检测Ctrl、WT和CA组以及联合不同药物处理后肿瘤细胞RAB5、RAB7、RAB11、RAB27A、RAB27B、RAB35和 ATG14 表达情况。Real time PCR验证WT和CA组RAB7 mRNA水平。Western blotting检测RAB7敲减后肿瘤细胞分泌sEVs中CD63和泛素化蛋白水平。免疫荧光共聚焦实验分析MVB形态和直径。Western blotting、免疫荧光共聚焦和NTA分别检测WT和CA组共转染RAB7-Q67L后肿瘤细胞分泌sEVs中CD63和泛素化蛋白水平,肿瘤细胞MVB形态和直径,肿瘤细胞分泌sEVs颗粒数。7、免疫荧光共聚焦实验分析MVB（标记物CD63）与SNAP23共定位情况,磷酸化分离胶检测CA细胞中SNAP23磷酸化水平情况,使用IKK抑制剂分析CA非NF-κB依赖性机制参与SNAP23磷酸水平的调控。设计突变失活95、110位SNAP23质粒,共转染CA-IKKβ质粒。Western blotting检测sEVs中CD63和泛素化蛋白表达水平,通过NTA示踪定量sEVs的浓度。合成SNAP23-Ser95抗体,western blotting检测Ctrl、WT和CA组以及联合不同药物处理后肿瘤细胞SNAP23-Ser95蛋白水平。结果:一、IKKβ激活诱导肿瘤细胞释放sEVs促进细胞存活:透射和免疫电镜揭示超速离心分离的典型sEVs结构,NTA显示CA组中分泌的颗粒数量增加了两倍,而sEVs（50-200 nm）的大小分布却没有受到影响（*P<0.05）。Western blotting结果表明CA组sEV标志物CD63、CD81和TSG101显著表达上调（**P<0.001,*P<0.05）,而且IKKβ活性抑制后sEVs标志物表达受到抑制。CCK-8结果揭示IKKβ激活以及其诱导的sEVs维持肿瘤细胞应激与存活（**P<0.001,*P<0.05）。二、IKKβ激活通过调控RAB7诱导肿瘤细胞生成amphisome:免疫荧光共聚焦实验证实IKKβ激活后肿瘤细胞内积累大量较大直径的MVBs（***P<0.0001）,然而早期内体无显著改变。Western blotting显示IKKβ激活细胞分离的sEVs中泛素化蛋白水平明显增加,而用IKK抑制剂对HeLa和Huh7细胞的处理会减弱sEVs中泛素化蛋白的产生。Western blotting结果表明,与Ctrl组相比,WT和CA组中LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ的表达水平显著增加（*P<0.05）。与Ctrl组相比,WT组p62水平显著降低（*P<0.05）。此外,与WT组相比,CA细胞中p62并没有被降解。免疫荧光共聚焦实验证实CA-IKKβ后自噬小体（LC3）与溶酶体（LAMP1）的共定位显著增加（*P<0.05）。双荧光stubRFP-sensGFP-LC3稳定细胞系分析持续激活IKKβ后肿瘤细胞自噬小体积聚。共聚焦荧光结果显示出CA细胞中CD63阳性MVB和LC3共定位显著上调（*P<0.05）。TEM在超微结构水平上证实CA细胞中自噬小体和MVB的融合情况。结果表明大量异质性囊泡结构积累,包括自噬小体、管腔中含有ILVs的经典MVB以及同时含有ILVs和自噬结构的amphisome。进一步分析显示CA中单位面积MVB和amphisome数量显著增加（*P<0.05）。Western blotting证实,CA-IKKβ细胞中RAB7显著降低（**P<0.001,*P<0.05）。抑制剂BAY11-7082（BAY）恢复了 CA-IKKβ 细胞中的 RAB7 蛋白水平。Real time PCR 结果显示CA组显著抑制肿瘤细胞中RAB7mRNA的水平（*P<0.05）。Western blotting和免疫荧光共聚焦实验证实稳定敲低RAB7会导致MVB直径明显变大（***P<0.0001）并诱导富含泛素化蛋白的sEVs产生。免疫荧光共聚焦实验证实RAB7-Q67L减弱了 CA-IKKβ引起的MVB直径的变化（*P<0.05）,western blotting显示同时影响了 sEVs的分泌和泛素化蛋白的含量。NTA结果显示RAB7-Q67L削弱了 CA-IKKβ诱导的肿瘤细胞sEVs的分泌（*P<0.05）。三、IKKβ激活诱导SNAP23-Ser95磷酸化促进amphisome依赖性分泌:免疫电镜标记证实p62驻留在CA-IKKβ转染的HeLa细胞中CD63标记的MVB中,但不在WT组中。免疫电镜CA-IKKβ来源的sEVs证实了胶体金标记的LC3抗体可以标记 sEVs。Western blotting 发现,LC3-Ⅱ 和 p62 在 CA-IKKβ 转染的 Huh7 和 HeLa细胞中的sEVs中高度富集。BAY和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）处理CA-IKKβ转染的细胞中的LC3-Ⅱ和p62水平降低,而通过Baf A1处理则适度增加了 LC3-Ⅱ和p62水平。在用ATG7稳定敲减的HeLa细胞中,western blotting发现IKKβ激活细胞来源的sEVs无显著LC3-Ⅱ和p62的表达。共聚焦分析表明,CA-IKKβ转染的细胞CD63与SNAP23共定位显著上调。磷酸化试剂证实CA-IKKβ显著增加了 p-SNAP23/SNAP23的比例（*P<0.05）,同时BAY处理可显著抑制CA-IKKβ诱导SNAP23磷酸化。Western blotting结果表明,SNAP23-S95A的表达显著消除了 CA-IKKβ诱导的含泛素化蛋白的sEVs分泌,而SNAP23-S110A无明显改变。本实验合成了识别磷酸化SNAP23-Ser95的抗体。使用磷酸化SNAP23-Ser95抗体在肿瘤细胞中检测了 SNAP23磷酸化水平（*P<0.05）,抑制剂BAY阻断SNAP23在CA-IKKβ细胞中第95位Ser残基的磷酸化。结论:本研究阐述了 CA-IKKβ通过抑制RAB7表达显著削弱了内体和自噬的溶酶体降解途径,进而诱导MVB与自噬小体融合形成amphisome,并且CA-IKKβ磷酸化SNAP23-Ser95诱导了 MVB或amphisome与细胞融合释放含有自噬相关成分的囊泡。在这项研究中,我们明确了 IKKβ激活的肿瘤细胞如何调控了自噬和内体系统的交互作用,揭示了肿瘤细胞在应激状态下新的存活适应机制。