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木质素是一种由苯基丙烷结构通过C-C键、C-O-C键等连接而成的无定形天然高分子聚合物。由于木质素结构的复杂性和连接键的稳定性,使其对生物降解具有很强的抗性。然而在自然界中仍然存在能够降解木质素的微生物,以黄孢原毛平革菌为代表的一类白腐真菌被认为是最有效的木质素降解菌。虽然真菌木质素降解的相关研究始于上世纪80年代,但是由于真菌在蛋白表达和基因操纵等方面存在很大的挑战,至今仍未能利用真菌开发出一种能够商业化应用的木质素生物降解技术。另一方面,近些年越来越多的研究却表明,细菌在液体基质中降解木质素展现出更多的优势和更广阔的应用前景。本文从被微生物腐蚀的三国吴简浸泡液中分离得到两株细菌Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9,能够以多种木质素单体模型化合物以及硫酸盐木质素和木质素磺酸盐为唯一碳源进行生长代谢,显示出高效全面的木质素降解潜力。为进一步确定Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9的木质素降解能力及其在木质素生物降解过程中的应用前景,对其降解木质素和相关降解基因展开了系统的研究。通过一系列的研究,取得了如下的创新性研究成果和结论：系统研究了菌株B-7和B-9的木质素降解性能,首次发现Novosphingo bium属和Comamonas属的菌株具有木质素降解能力。在硫酸盐木质素为唯一碳源的液质培养基中研究了Novosphingobium sp.B-7和Comamonas sp. B-9木质素的降解性能,结果表明,菌株Novosphingobium sp. B-7在7天内分别可以使木质素含量、总碳、COD和色度下降38.84%、50.11%、34.7%、51.94%；相应的Comamonas sp.B-9降解效率则分别为45.06%、47.23%、32%、53.97%。同时,检测出Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9通过分泌关键的胞外木质素降解酶来降解木质素,其锰过氧化物酶和漆酶活性分别达到3229.8U·L-1、2903.2U·L-1和1275U·L-1、1250U·L-1。综合各项木质素降解相关的数据证明,Novosphingobium sp.B-7和Comamonas sp. B-9不但能够以木质素作为唯一碳源进行生长代谢,还具备高效的木质素降解能力。阐明了Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9对木质素解聚途径和脱色机制。凝胶渗透色谱和GC-MS检测结果表明,Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9对木质素具有良好的解聚能力,能够将木质素高聚物解聚成低聚物,并进一步降解成木质素单体苯化合物直至进入三羧酸循环被矿化。在Novosphingobium sp.B-7和Comamonas sp. B-9木质素降解产物中,存在多种有价值的化工产品和醇类物质,如香草酸、乙二醇等,表明Novosphingobium sp.B-7和Comamonas sp. B-9具有通过生物工程改造由木质素生产化工产品的应用价值。此外,紫外吸收光谱和FT-IR红外吸收光谱表明,Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9能够破坏硫酸盐木质素中的苯环结构、共轭烯键以及共轭羰基等发色基团,使硫酸盐木质素脱色。准确测定了Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9的全基因组序列,并对其木质素降解相关基因进行了克隆、鉴定和分析。通过全基因组测序和生物信息学分析,Novosphingobium sp. B-7的基因组大小为4.06Mb, GC含量为65.11%；Comamonas sp. B-9的基因组大小为4.57Mb, GC含量为63.62%。采用Glimmer3.0基因预测软件对测序数据进行基因de novo预测,分别从Novosphingobium sp.B-7和Comamonas sp. B-9的基因组中预测得到4639和4990个基因。经KEGG.COG等数据库对基因组进行注释,在Novosphingobium sp.B-7和Comamonas sp. B-9的基因组注释结果中,分别发现了60个和45个木质素降解酶编码基因。这些基因包括降解木质素聚合物主体结构的漆酶类和过氧化物酶类的编码基因、断裂p-0-4结构的β-etherase编码基因以及使苯环开环的儿茶酚-1,2-双加氧酶、原儿茶酸-4,5-双加氧酶等蛋白的编码基因。采用序列特异性引物,分别对Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9中的22个木质素降解相关基因进行了PCR以及RT-PCR克隆,成功获取了相应的基因片段,并通过重测序和nr/nt库BLAST比对这22个基因进行了鉴定,表明Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9全基因测序和注释具有高度的准确性。由于Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9不但具有高效的木质素降解性能,还能通过降解木质素生成有价值的化工产品,因此利用Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9不但能开发出相应的生物技术应用于处理造纸黑液等木质素造成的环境污染问题,还可应用于降解木质素生产如香草酸等有价值的化工产品。此外,生物信息学分析表明,Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9能够编码木质素高聚物→低聚物→单体→开环产物→三羧酸循环整个木质素生物降解过程所需要的所有的酶,从基因层面证实了Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9高效全面的木质素降解能力,也为利用Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9构建生产木质素降解酶的基因工程菌提供了非常有价值的研究数据。可以预见,Novosphingobium sp. B-7和Comamonas sp. B-9在木质素的生物转化过程中具有极大应用价值。