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目的：
本研究通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制造糖尿病(Diabetes mellitus,DM)小鼠模型,长时间观察内质网应激(ER Stress)通路标识物及相关蛋白在DM小鼠海马表达的动态变化,研究ER Stress在糖尿病脑病海马神经元变性过程中的作用,探索糖尿病脑病的发病机制。
方法：
140只昆明小鼠随机分为正常对照组和DM组。DM组小鼠按200mg/kg剂量腹腔注射STZ,正常对照组注射等体积柠檬酸缓冲液,3天后小鼠尾静脉随机血糖≥15mmol/L为造模成功。在造模后4W、8W及12W,行Morris水迷宫实验。用免疫组织化学染色方法检测正常对照组和造模后72h、1W、4W、8W及12W DM组小鼠海马CA1区β淀粉样蛋白42(Aβ2)、Aβ结合蛋白(ERAB)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)、凋亡相关蛋白(BAX和BCL-2)以及神经生长因子(NGF)表达的变化；利用免疫荧光双标观察GRP78/NeuN及CHOP/NeuN是否共表达；用免疫组织化学染色及Western blotting方法检测造模后2h、6h、24h、72h、1W、4W、8W及12W,DM组小鼠海马内ER Stress标识物葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达的改变,以及造模后72h、1W、4W、8W及12W DM组小鼠海马内ER Stress凋亡途径特异蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)表达的改变。
结果：
1.Morris水迷宫实验结果
分别在造模后4W、8W及12W行水迷宫测试。在测试第1d,各时间点正常对照组与DM组小鼠逃避潜伏期均无明显差异；测试第2d至第5d,DM组小鼠的逃避潜伏期与正常对照组相比均明显延长(P<0.05)；比较造模后4W、8W及12W DM组小鼠的逃避潜伏期成绩,没有明显变化。说明腹腔注射STZ诱导的DM小鼠存在学习记忆障碍,但此障碍在12W内没有进行性加重的趋势。
2.小鼠海马CA1区Aβ42、ERAB和ChAT免疫组织化学染色结果
正常对照组小鼠海马CA1区Aβ42和ERAB阳性细胞数量少,染色浅,ChAT阳性细胞数量多,染色深。造模后4W、8W及12W,DM组小鼠海马CA1区Aβ42阳性细胞染色深,数量比正常对照组明显增加(P<0.05)。造模后72h、1W、4W、8W及12W,DM组小鼠海马CA1区ERAB阳性细胞数量比正常对照组明显增多(P<0.05),染色深。造模后72h、1W、4W、8W和12W,DM组小鼠海马CA1区ChAT阳性细胞数比正常对照组明显减少(P<0.05),染色浅。
3.小鼠海马CA1区GRP78/NeuN与CHOP/NeuN免疫荧光双标结果
正常对照组与DM组小鼠海马CA1区均存在大量的NeuN阳性染色细胞,正常对照组小鼠海马CA1区GRP78阳性细胞数量少,荧光弱。与正常对照组相比,造模后24h DM组小鼠海马CA1区GRP78阳性染色细胞数量多,荧光强度强。正常对照组与DM组小鼠海马CA1区GRP78和NeuN均共表达,且DM组小鼠GRP78/NeuN双染细胞较正常对照组数量多,荧光强度强。
正常对照组小鼠海马CA1区CHOP阳性染色细胞少,荧光强度弱,而DM组小鼠海马CA1区CHOP阳性染色细胞比正常对照组明显增多,荧光强度强。正常对照组与DM组小鼠海马CA1区CHOP和NeuN均共表达,且DM组CHOP/NeuN双染细胞数量较正常对照组明显增多。
4.小鼠海马CA1区ER Stress标识物GRP78及CHOP免疫组织化学染色结果
正常对照组各时间点小鼠海马CA1区GRP78及CHOP阳性细胞数量少,染色浅。造模后6h及24h DM组小鼠海马CA1区GRP78阳性细胞染色深,数量比正常对照组明显增加(P<0.05),其余时间点两组小鼠海马CA1区GRP78阳性细胞数量无明显差异。
造模后72h,DM组小鼠海马CA1区CHOP阳性细胞染色深,造模后1W、4W、8W及12W,DM组小鼠海马CA1区CHOP阳性细胞染色明显加深,数量比正常对照组明显增多(P<0.05)。
5.Western blotting方法检测小鼠海马内GRP78及CHOP表达的结果
造模后24h及72h,DM组小鼠海马内GRP78蛋白表达比正常对照组明显增加,两组相对光密度值相比有显著性差异(P<0.05)；造模后72h,DM组小鼠海马CHOP表达稍增加,造模后1W、4W、8W及12W,DM组小鼠海马CHOP蛋白表达明显增加,相对光密度值与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05)。
6.小鼠海马CA1区BAX、BCL-2及NGF免疫组织化学染色结果
正常对照组小鼠海马CA1区BAX阳性细胞数量少,染色浅,BCL-2和NGF阳性细胞数量多,染色深造模后1W和4W DM组小鼠BAX阳性细胞数量比正常对照组明显增多(P<0.05),染色深。造模后72h、1W、4W、8W和12W,DM组小鼠海马CA1区BCL-2阳性细胞数与正常对照组相比明显减少(P<0.05),染色变浅。造模后72h、1W、4W、8W及12W,DM组小鼠海马CA1区NGF阳性细胞胞浆染色比正常对照组稍浅,但两组间NGF阳性细胞数量没有明显差异。
造模后72h、1W、4W、8W及12W DM组小鼠BCL-2/BAX比值均低于正常对照组。比较造模后不同时间点DM组小鼠海马内BCL-2/BAX的比值发现,在造模后72h,DM组小鼠海马CA1区BCL-2/BAX比值处于相对较高水平,随着造模时间的延长(1W-12W),BCL-2/BAX比值逐渐下降,至造模后12W达到最低。
结论：
1.腹腔注射STZ后4W、8W及12W,DM小鼠出现学习记忆功能障碍。在实验观察的时间范围内(12W),此障碍没有进行性加重的趋势。
2.DM早期小鼠脑内ERAB表达增加,并可与产生的Aβ42完全结合。随着DM病程的延长,DM小鼠脑内Aβ42及ERAB的表达持续增加,ERAB已不能结合掉细胞内全部的Aβ42沉积,使得ERAB表达和Aβ42沉积均明显增加。同时,DM组小鼠海马内ChAT阳性细胞数量持续减少,导致胆碱能神经元功能低下,这可能是DM小鼠海马神经元退行性变性、学习记忆功能障碍的重要原因之一。
3.Aβ等蛋白沉积诱导DM小鼠海马神经元发生ER Stress,早期海马神经元通过上调GRP78表达以缓解ER Stress,随着DM时间的延长,ER Stress特异性凋亡蛋白CHOP表达增加,促进细胞凋亡。因此,ER Stress在DM脑病的发病机制中具有重要作用。
4.腹腔注射STZ后,DM组小鼠海马内BAX表达增加、BCL-2表达减少、BCL-2/BAX比值下降,并且随着DM时间的延长,BCL-2/BAX比值逐渐下降,至实验终点,DM小鼠海马内BCL-2/BAX比值最低,说明DM小鼠海马受损神经元不断发生凋亡,且随着DM病程的延长,细胞凋亡逐渐增多。
5.ER Stress诱导的凋亡以及BCL-2/BAX诱导的凋亡可能是糖尿病脑病发生发展的重要原因。