目的：结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界上发病仅次于肺癌和乳腺癌的第三大高发恶性肿瘤，根据世界卫生组织国际癌症研究机构(InternationalAgency for Research on Cancer，IARC)公布的资料，2002年全球结直肠癌新病例占全部癌症的9.4％。每年大约850，000人发病，500，000人死亡，死亡病例超过发病数的一半以上，结直肠癌已成为高发病率和高致死率的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。近年来，随着工业化进程，居民饮食结构、生活习惯的改变以及人口老龄化加速，我国结直肠癌发病率和死亡率亦呈逐年上升态势，2005年我国结直肠癌发病数和死亡数分别达172，000和99，000，已超过美国，给人民健康和社会生产力的发展造成了沉重的负担。目前，手术切除病灶是结直肠癌治疗的首选，但术后由于微小肿瘤灶或循环CRC细胞(circulating tumor cells，CTCs)的存在，肿瘤复发、浸润和远处转移等恶性生物学行为，是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。据统计，90％的恶性肿瘤患者死于肿瘤的转移、复发，而常规的手术治疗、化疗、放疗难以对其进行有效逆转，50％～70％左右的结直肠癌患者术后出现复发或转移，其中绝大多数患者失去再治愈的机会，中位生存期只有大约24个月。如何有效地早期检测和靶点治疗肿瘤的侵袭转移，寻找新的肿瘤标志物以便及早诊断和进行个体化治疗，是降低癌症恶性行为的关键。因此，研究结直肠癌的转移、复发机制及其防治方法具有重要意义。目前，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)、家族性腺瘤性息肉病及遗传性非息肉病性结直肠癌（Lynch综合征）被认为是结直肠癌发病的三大独立高危因素。在上述三大高危因素中，由于溃疡性结肠炎发展至溃疡性结肠炎相关性结直肠癌(ulcerative colitis-associated colorectal cancer，ucCRC)是一个“炎症-不典型增生-癌变”的稽延事件，这就为预防干预措施提供了有利的机遇，因此，国内外对于溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结直肠癌的发病与防治机制的研究更为广泛且深入。与许多肿瘤的发生、发展都伴有慢性炎症的发展过程一样，在结直肠癌中，结肠炎症与炎症相关性结直肠癌(colitis-associated colorectal cancer，caCRC)的发生、发展密切相关。溃疡性结肠炎又称非特异性溃疡性结肠炎，和克罗恩氏病(Crohns disease，CD)同属于炎症性肠病(inflammatory boweldisease，IBD)，是非可控性的结肠炎症。ucCRC是UC严重并发症之一，虽然只占所有结直肠癌发病率的1％～4％左右，但却占UC患者死亡例数的10％～15％。结直肠癌的发生与UC患者炎症的病变范围、病程等因素呈正相关。Eaden等的一项荟萃分析显示病程10年、20年和30年的UC患者癌变风险分别为2％，8％和18％，比一般人群高2.6～5.4倍，病程超过10年及广泛性或全结肠炎患者癌变危险性最高。与散发性结直肠癌(sporadic colorectal cancer，sCRC)相比，ucCRC发病年龄更年轻，平均年龄为43.2岁，且“炎症-不典型增生-癌变”过程比一般人群“腺瘤-腺癌”进展更为迅速，平均病程为16.3年。与sCRC不同，ucCRC可表现为多病灶，并且全结肠粘膜均有高度恶变危险，从平坦型病变或非息肉状不典型增生进展为浸润性癌的概率更高。因此，UC和ucCRC已引起临床工作者及科研人员的高度重视。溃疡性结肠炎相关性结直肠癌与传统意义上的结直肠癌相似，其发病为一涉及多基因、多通路、多事件的复杂过程。而与经典结直肠癌的“腺瘤-腺癌”序列不同，溃疡性结肠炎发展至结直肠癌经历了“炎症-不典型增生-癌症”的序列演进。鉴于ucCRC的发生与UC患者炎症的病变范围、病程等因素呈正相关，炎症在肿瘤的启动、促进与进展中发挥重要作用，目前对溃疡性结肠炎及其相关性结直肠癌发病机制的研究集中在从全基因组转录水平与蛋白表达水平两个层面全面、深入地探讨“炎-癌”链中的分子事件及其交互作用网络，从而阻断“炎-癌”链进程。研究表明，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)事件是“炎-癌”链中的重要事件。EMT是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞发生转化的现象。已有大量的研究证据表明，在多数肿瘤的原位已有EMT的发生。EMT现象与肿瘤的侵袭转移密切相关，在多种癌症的原位浸润和远处转移中发挥重要作用。对结肠癌的研究表明，肿瘤细胞外形的改变及其粘附性的下降或消失，在肿瘤的原位侵袭和远处转移及新转移灶的形成过程中发挥了重要的作用。近年来，EMT在肿瘤方面的研究越来越多，其发生可能与肿瘤侵袭转移能力以及肿瘤干细胞特性的获得密切相关，因而已成为胃肠道肿瘤研究的又一热点。EMT由精确的细胞内信号转导机制调控，各种细胞外信号通过与细胞表面的特异性受体结合，将相应的信号转入细胞内，然后通过相应的细胞内信号转导通路，使核内的转录因子活化从而调节基因表达，完成EMT。大量临床及实验研究表明，中医药具有一定的抗肿瘤转移作用，鉴于上皮-间质转化在肿瘤转移中的作用，推测部分中药可能通过上皮-间质转化途径发挥作用。研究中医药对EMT是否具有抑制作用，不仅可以为中医药抗肿瘤转移、提高临床疗效提供新的实验依据，同时可以体现中医药抗肿瘤侵袭转移的多靶点治疗作用，因此开展相关研究具有重要意义。中医学虽无“溃疡性结肠炎”这一病名，但其将具有“腹泻腹痛、里急后重和下痢赤白脓血便”表现的疾病，统归于“痢疾”的范畴。痢疾在不同的历史时期，又被称为“肠澼”、“滞下”、“久痢”、“休息痢”等，且“休息痢”一词使用广泛。“痢疾”与现代医学的“溃疡性结肠炎”具有相同的临床表现。中医药在“痢疾”的防治上积累了丰富的经验，治疗上取得了比较满意的疗效。从春秋战国时期到清朝末年，历经二千余年，积累了大量的文献资料。文献计量分析表明，2002～2012年国内临床及科研工作者对于中医药治疗溃疡性结肠炎方面做了大量的研究工作，发表了大量的文献，而到2011年，中医药治疗溃疡性结肠炎的研究迅速增长，说明该病已经越来越受到中医临床工作者和科研人员的重视。虽然近年来中医药成为临床治疗溃疡性结肠炎的热点，并且取得了很大进展。但尚存在以下几方面问题:一、目前国内中医药界对UC的辨证分型标准尚未完全达成一致共识;二、临床上针对UC同一证型缺乏公认统一的治疗方药，共同运用的中成药不多;三、中医药治疗UC的研究多数局限于临床观察阶段，对作用靶点及机制的探讨已有一定进展，药理作用机制研究大多着眼在中药的抑制促炎细胞因子（如IL-6、IL-8、TNF-α）、上调抗炎细胞因子（如IL-10）方面。中医药在抗炎免疫和分子基因水平的研究还处于初期阶段，机制研究不够深入。芍药汤(Shaoyao Decoction，SYD)出自金·刘河间所著医学六书之《素问病机气宜保命集》，由芍药、黄连、黄芩、大黄、当归、肉桂、槟榔、木香、甘草共9味中药组成，具有清热燥湿、调和气血之功效，原书有“芍药汤，下血调气。《经》曰:泻而便脓血，气行而血止。行血则便脓自愈，调气则后重自除。”主治“痢疾”。为治疗溃疡性结肠炎的常用方剂。国内外尚无芍药汤防治溃疡性结肠炎及其相关性结直肠癌EMT的机制研究。本研究以芍药汤为研究对象，以其防治结肠炎相关性结直肠癌EMT的机制为切入点，旨在对溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结直肠癌发生过程中“炎症-不典型增生-癌症”序列演变过程的转录水平机制及“炎-癌”调控网络中的关键信号通路与分子的变化进行分析，为溃疡性结肠炎及其相关性结直肠癌的发病机制和临床诊疗提供理论依据。有助于进一步解释、明确中药芍药汤的药理作用，为中医药更广泛、更准确地应用于临床提供了一条新思路，也为开发治疗IBD的新型中药新药奠定理论基础。　　 方法：⑴采用SPF级5～8周龄雄性C57BL/6J小鼠，复制氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulphate，DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结直肠癌模型。⑵实验开始前，记录小鼠体质量等基本情况。自由喂养1周，小鼠按体重随机分为正常对照组、模型组（AOM/DSS组）、芍药汤组（AOM/DSS+SYD组）共3组。实验开始后，每日观察记录各组小鼠的外观体征、粪便性状及有无脓血便等情况，每周观察记录各组小鼠的体质量、食物消耗等，以评估疾病活动情况。⑶实验第11周末将小鼠麻醉后脱颈椎处死，取出结直肠（从肛缘至回盲部）测量其重量及长度，观察粘膜炎症、糜烂、溃疡及成瘤情况，制作结直肠组织HE染色石蜡切片，由病理学专业人员阅片，按既有标准区分结直肠粘膜溃疡、不典型增生及癌变（类型与分化）。⑷髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一群表型异质性的处于不同分化阶段的未成熟髓系细胞，具有免疫无能和免疫抑制功能，MDSCs可存在于荷瘤小鼠的脾脏、血液及肿瘤组织或者癌症患者的外周血及肿瘤组织中。人与小鼠一样，MDSC也分为粒细胞样和单核细胞样（单个核和分叶核）两个主要亚群。肿瘤模型小鼠中，单个核类MDSCs典型的标记性分子是CD11b和Ly-6C，而分叶核类MDSCs的典型标记分子是CD11b和Ly-6G;在肿瘤患者中，MDSCs同时表达CD11和CD33等分子而不表达人白细胞抗原DR。MDSCs由肿瘤微环境，如IL-1β、IL-6、IL-10、VEGF、GM-CSF、PGE2等诱导产生。肿瘤产生过程中其在淋巴器官（如脾脏）、血液以及病变部位聚集。针对不同的免疫细胞群，其通过分泌抑制性因子、接触性抑制以及诱导产生其他抑制性细胞等各种方式发挥免疫抑制作用，进而抑制天然免疫和适应性免疫。MDSCs在肿瘤组织、淋巴结或血液循环中的聚集是肿瘤逃避免疫攻击的一个重要机制。本研究中，我们用流式细胞技术分析各组小鼠脾脏中MDSCs的变化，验证MDSCs变化与结肠炎及结直肠癌的关系，证实模型的有效性和治疗组药物芍药汤在调节MDSCs方面所发挥的抗“炎-癌”链作用。⑸免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法(Western blot)分析3组小鼠结直肠组织中癌相关蛋白，如β-catenin、PCNA、P53、COX-2、GSK-3β及Phospho-GSK-3β的表达，以期分析“炎-癌”链中不同分子事件（如EMT等）及与之相关联的信号通路（如Wnt/β-catenin信号通路等）之间的交互作用网络，并探讨中药芍药汤在阻断“炎-癌”链进程方面的作用。　　 结果：①复制了AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎及结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养1周，单次小剂量(12.5mg/kg)腹腔注射化学诱变剂氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)。1周后予以饮用含3.5％致炎剂葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulphate，DSS)的饮用水7天，接着饮用普通无菌水14天，DSS致炎再循环重复两次，我们成功复制了溃疡性结肠炎及其相关性癌小鼠模型。该模型与人类溃疡性结肠炎及其相关性癌有以下相似特征:(1)模型小鼠均有腹泻、粘液脓血便、体重下降等与人溃疡性结肠炎-溃疡性结肠炎相关性结直肠癌相同的外观体征。(2)病理组织学观察，诱变致炎后小鼠结直肠出现明显的炎症反应，大量炎性细胞浸润，糜烂与溃疡从大肠远端向近端发展;结直肠癌肿病灶呈多发性，腺癌多见。以上发现证实该模型可较好地模拟人溃疡性结肠炎与结肠炎相关性结直肠癌，有科学利用价值，可为后续的研究提供保障。②实验结束，小鼠称重麻醉后脱颈椎处死，超净台内无菌取出其结直肠及脾脏，计算结直肠肠重系数及脾重系数，肉眼及显微镜下观察评价结直肠组织学损伤指数。结果显示:模型组、芍药汤组两组小鼠体重均较正常对照组显著减轻（P＜0.05);模型组、芍药汤组两组小鼠脾重系数均较正常对照组显著增高（P＜0.05)，芍药汤组小鼠脾重系数较模型组显著降低（P＜0.05）;模型组小鼠肠重系数较正常对照组显著增高（P＜0.05)，芍药汤组小鼠肠重系数较模型组显著降低（P＜0.05);模型组、芍药汤组两组小鼠结直肠组织学损伤指数均较正常对照组显著增高（P＜0.05)，芍药汤组小鼠结直肠组织学损伤指数较模型组显著降低（P＜0.05）。③实验结束，小鼠称重麻醉后脱颈椎处死，超净台内无菌取出其结直肠，完成重量、长度测量指标后，肉眼及立体显微镜下观察结直肠成瘤情况。正常对照组小鼠结直肠部位均未发现瘤变，模型组、芍药汤组两组小鼠结直肠部位均见明显肿瘤，模型组小鼠结直肠癌肿病灶多发生于中末段，芍药汤组小鼠结直肠癌肿病灶多发于结肠中段，且结肠大癌肿(直径＞3mm)总发生率较模型组少。芍药汤组小鼠总瘤体个数较模型组少（P＜0.05）;模型组、芍药汤组两组小鼠结直肠长度均较正常对照组缩短（P＜0.05);模型组小鼠结肠重量较正常对照组增加（P＜0.05)，芍药汤组小鼠结肠重量与正常对照组比较，差异无统计学意义（P=0.902），芍药汤组小鼠结肠重量较模型组减轻（P＜0.05);模型组小鼠结肠重量长度比值较正常对照组增大（P＜0.05)，芍药汤组小鼠结肠重量长度比值与正常对照组比较，差异无统计学意义（P=0.280），芍药汤组小鼠结肠重量长度比值较模型对照组小（P＜0.05)。④模型组、芍药汤组小鼠脾脏中MDSCs的比例明显高于正常对照组（P＜0.05);芍药汤组小鼠脾脏中MDSCs的比例明显低于模型组（P＜0.05)。⑤正常对照组、模型对照组、芍药汤治疗组3组小鼠结肠细胞β-catenin、PCNA、COX-2和p53四个癌蛋白的表达情况分别通过免疫组化SP染色法和蛋白免疫印迹法检测判定。研究发现，模型对照组、芍药汤治疗组小鼠β-catenin、PCNA、COX-2和p53核内阳性表达率均较正常对照组高（P＜0.05）;芍药汤治疗组小鼠细胞核β-catenin、PCNA、COX-2和p53阳性表达率较模型对照组低（P＜0.05）。⑥研究证实，癌基因、抑癌基因或Wnt信号通路成分的突变使该通路不恰当地激活则与消化道肿瘤的发生、发展过程中的EMT密切相关。肿瘤发生中Wnt通路的异常激活是以β-catenin的变化为中心的，β-catenin的核转移引起其下游靶基因的异常激活，诱发细胞癌变。本研究通过Western blot分析检测与Wnt信号通路相关联的癌蛋白和分子，结果发现，与结直肠癌密切相关的4种癌蛋白在AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎及其相关性结直肠癌小鼠模型中呈现高表达，而芍药汤能够明显抑制癌蛋白的过高表达。上皮-间质转化(EMT)的发生需要Wnt/β-catenin信号通路的激活，Wnt/β-catenin信号通路激活与GSK-3β、β-catenin在胞浆内的高表达密切相关，而GSK-3β的磷酸化可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。在AOM/DSS诱导的溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型中GSK-3β、β-catenin呈现高表达，同时，Phospho-GSK-3β呈现低表达，说明芍药汤通过抑制GSK-3β、β-catenin的高表达，促进GSK-3β磷酸化而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而阻断EMT过程，起到防治溃疡性结肠炎及结肠炎相关性结直肠癌的作用。　　 结论：本研究成功复制了AOM/DSS致溃疡性结肠炎及溃疡性结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型，利用模型研究了“炎症-不典型增生-癌症”序列演进过程中转录水平机制及“炎-癌”调控网络中的关键事件EMT及其相关联的信号通路的变化，同时，观察了中药芍药汤在其中的作用，这将为进一步探索“炎-癌”链的相关分子机制及其调控网络提供实验依据，同时提示临床工作者应高度重视对慢性炎症的预防与治疗，阻止炎症的恶性转化。本研究首次提出了芍药汤通过调控Wnt/β-catenin信号通路，从而阻断“炎-癌”链中的上皮-间质转化事件，起到防治溃疡性结肠炎及结肠炎相关性结直肠癌的作用，这不仅进一步深化了芍药汤效用的机制研究，而且为临床疗效肯定的中药方剂研究提供新思路，也为开发治疗炎症性肠病的新型中药新药奠定理论基础。