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miR-375在调节胰岛中胰岛素和垂体促肾上腺皮质激素(Adreno-corticotropical hormone,ACTH)合成和分泌等内分泌过程中发挥了重要功能,是一种内分泌相关的小RNA。近来,有文献报道miR-375在鸡卵巢中表达,但miR-375在卵巢中的具体功能及相关调控机制尚不清楚。CRH是重要的应激和炎症调控因子,已有大量研究表明CRH能抑制卵巢细胞中类固醇激素的合成。本研究主要以猪为实验动物模型,通过体内体外实验方法研究miR-375在成年猪卵巢中的主要功能以及与CRH信号通路的相互作用关系,主要研究内容和结果包括以下几个方面:1.利用RT-qPCR和原位杂交(insituhybridization,ISH)的方法检测miR-375在猪卵巢中的表达。结果显示,miR-375在所有颗粒细胞中均表达,提示miR-375可能在猪颗粒细胞中发挥了重要功能。2.在体外培养的猪颗粒细胞中转染miR-375模拟物(miR-375 mimic)过表达miR-375或miR-375抑制物(miR-375 inhibitor)抑制胞内miR-375水平,研究miR-375对猪颗粒细胞中类固醇激素合成和增殖凋亡的影响。结果显示,miR-375过表达或抑制后,能明显影响猪颗粒细胞雌二醇(Estradiol,E2)的产生,对孕酮(Progesterone,P4)的产生以及细胞增殖凋亡均没有明显的影响。进一步利用RT-qPCR的方法检测猪颗粒细胞中E2合成关键酶的表达。结果表明,miR-375抑制猪颗粒细胞E2合成依赖于细胞色素P450 19A1(CytochromeP450,family19,subfamilyA member 1,Cyp19a1)的表达。3.ISH结果证明,在猪卵巢中只表达CRH 1型受体CRHR1(CRH receptor 1),而CRHR2不表达,说明在猪卵巢中CRH主要通过结合CRHR1来发挥相应的功能。体内体外实验证明,促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)可上调猪卵巢和颗粒细胞中miR-375的表达。利用蛋白激酶A(ProteinkinaseA,PKA)等信号通路抑制剂预处理体外培养的猪颗粒细胞。结果显示,CRH通过PKA-p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK)信号通路调节miR-375的表达。此外,CRH可以快速提高p38MAPK磷酸化水平,说明CRH通过快速磷酸化p38 MAPK蛋白,进而激活p38 MAPK信号通路。4.体内体外实验证明,CRH对猪颗粒细胞中E2合成和Cyp19a1的表达具有明显的抑制作用。此外,过表达miR-375可以增强CRH对Cyp19a1基因表达和E2合成的抑制作用,而抑制胞内miR-375水平能抑制CRH对Cyp19a1基因表达和E2合成的调节作用,说明miR-375介导了CRH对猪颗粒细胞E2合成的抑制作用。5.根据生物信息学方法预测,特异性蛋白1(Specificity protein 1,Sp1)、肝受体类似物1(Liver receptor homolog 1,Lhr1)和上游转录因子 1(Upstream transcription factor 1,Usf1)是miR-375潜在的靶基因,经双荧光素酶及Western blot的方法验证,Sp1是miR-375在猪颗粒细胞中的直接靶基因。进一步实验结果证明,Sp1是miR-375和CRH共同的下游分子,且miR-375介导了猪颗粒细胞中CRH对Sp1的表达调控。双荧光素酶实验结果显示,过表达Sp1可以显著上调Cyp19a1启动子活性,说明SP1通过调节Cyp19a1启动子活性从而调节其表达。综上所述,CRH通过结合受体CRHR1,激活胞内PKA-p38 MAPK信号通路,进而促进miR-375表达,miR-375抑制靶基因SP1蛋白水平,从而调节Cyp19a1转录来调节猪颗粒细胞中E2的合成。以上研究结果为CRH在调节颗粒细胞类固醇激素的功能和机理方面的研究提供了新视角,为类固醇激素分泌失调相关的生殖紊乱治疗提供了新的潜在分子靶点。