研究背景：最近发表于Nature的研究结果发现，在锻炼中，骨骼肌细胞能增加一种人纤维连结蛋白III型域包含蛋白5（Human Fibronectin type III domain-containing protein5，FNDC5）的水平，后者能促使解耦联蛋白（UCP1）的表达和增加白色脂肪向棕色脂肪的转化，从而促进机体的能量代谢和产热作用，同时FNDC5蛋白还能增加脂肪组织胰岛素信号的敏感性。上述研究发现已授权给Ember Therapeutics生物技术公司，计划开发FNDC5作为肥胖和糖尿病的新治疗方法。因此，对于FNDC5的研究可能是未来心血管领域的热点。令人遗憾的是，目前国内还不能生产FNDC5蛋白，研究用FNDC5蛋白需要进口，价格非常昂贵，极大限制了国内开展FNDC5的科学研究，尤其限制了对蛋白需求量大的动物研究。因此，如何有效的表达、纯化、获得有活性的FNDC5是我们深入FNDC5在糖尿病、肥胖及代谢性疾病领域研究的关键。糖脂代谢紊乱使葡萄糖及脂质蓄积在胰岛素敏感组织，比如骨骼肌和肝脏，最终导致胰岛素抵抗及糖尿病。因此，如何有效改善糖尿病糖脂代谢紊乱将是预防糖尿病及并发症的关键。脂肪酸β氧化是脂代谢重要组成部分，脂肪酸乙酰CoA羧化酶（Acetyl-CoAcarboxylase，ACC）是调节脂肪酸代谢的关键酶，其中ACCβ是ACC的主要同工酶，位于骨骼肌。运动可以激活AMPK使ACCβ磷酸化增加，导致ACCβ活性受到抑制，从而促进脂肪酸β氧化。因此，改善骨骼肌对脂肪酸的β氧化将有效改善糖尿病脂代谢紊乱。糖异生增加是糖尿病患者糖代谢异常的重要原因，糖尿病状态下，肝脏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)以及葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)等糖异生关键酶活性增加，导致血糖增加。因此，对于糖异生的调节是治疗糖尿病糖代谢紊乱的有效手段之一。但是FNDC5是否能通过调节骨骼肌脂肪酸的β氧化以及肝脏糖异生从而改善糖脂代谢目前仍不清楚。因此，本课研究通过基因工程方法，成功制备出有活性的FNDC5，并观察其对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响，进一步探讨FNDC5对糖脂代谢的影响是否与调节脂肪酸β氧化及肝脏糖异生有关。研究目的：1.利用基因工程方法来制备具有活性FNDC5。2.观察FNDC5对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响，进一步探讨FNDC5对糖脂代谢的影响是否与调节脂肪酸β氧化及肝脏糖异生有关。实验方法：实验1：利用基因工程方法来制备具有活性FNDC51从小鼠的肌肉组织里提取总RNA，反转录合成cDNA，然后经过PCR扩增、酶切后与pET-28a(+)载体连接，构建重组质粒pET-28a(+)-FNDC5。2将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，经过低温、低浓度的IPTG诱导使其可溶性表达，然后采用镍柱亲和层析法纯化FNDC5蛋白3运用SDS-PAGE、Western blotting对蛋白进行鉴定，利用注射小鼠腹腔后检测棕色脂肪组织中UCP-1的表达量来验证其活性。实验2：观察FNDC5对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响，进一步探讨FNDC5对糖脂代谢的影响是否与调节脂肪酸β氧化及肝脏糖异生有关1.T2DM小鼠模型的建立采用喂养高脂饮食结合小剂量STZ腹腔注射建立T2DM小鼠模型。小鼠适应性饲养1周后，随机分为两组，即正常饮食(nomal diet，ND)组(n=40)和高脂饮食(high Fat diet，HD)组(n=60)，于第6周后，HD组给予小剂量的STZ（50mg/kg，用0.1mmol/L的柠檬酸盐缓冲液溶解）。每周检测两组小鼠的血糖水平、12周时眼眶取血检测小鼠血浆胰岛素水平，并进行腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)。当血糖的水平高于11.0mmol/L且葡萄糖耐量出现异常和胰岛素水平升高者，则可认为T2DM小鼠造模成功。2.FNDC5对T2DM小鼠即时血糖的影响小鼠随机分为T2DM+生理盐水组和T2DM+FNDC5组，每组8只。用血糖仪检测两组在注射后30、60、90、120、150、180、210min的血糖水平。3.FNDC5对T2DM小鼠长期血脂、葡萄糖耐量、体重的影响。小鼠随机分为4组：Control组、Control+FNDC5组、T2DM组和T2DM+FNDC5组，每组8只，每天给予腹腔注射FNDC5（1mg/kg），共2周。2周后检测葡萄糖耐量的改变，完后处死小鼠，检测血脂、体重的水平变化。4.肝脏组织中G6Pase、PEPCK和骨骼肌中P-ACC-β的检测用Western blot检测上述给药2周后小鼠的葡萄糖-6磷酸酶(G-6Pase)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)及P-ACCβ的水平。实验结果：实验1：利用基因工程方法来制备具有活性FNDC51.成功构建了原核表达载体pET-28a (+)-FNDC5。2.成功的将质粒转入大肠杆菌感受态细胞，并分离纯化得到FNDC5。3.经过SDS-PAGE与Western-Blot鉴定后发现上述所纯化的蛋白即为FNDC5蛋白，并且可以增加小鼠棕色脂肪中UCP-1的表达量，证明制备的FNDC5具有活性。实验2：观察FNDC5对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响，进一步探讨FNDC5对糖脂代谢的影响是否与调节脂肪酸β氧化及肝脏糖异生有关1.T2DM小鼠模型的建立与正常饮食组组（ND）比较，高脂饮食组（HD）血糖于6周开始明显增高（P<0.05）。IPGTT的结果显示，HD组与ND组经腹腔注射葡萄糖后血糖迅速升高，于30min达到最大值，随后血糖下降，与ND组相比，HD组血糖下降缓慢（P<0.05），说明出现葡萄糖耐量异常。胰岛素检测结果显示，与ND组相比，HD组胰岛素水平明显升高（P<0.05）,综上所述，说明已成功地建立T2DM小鼠模型。2.FNDC5对T2DM小鼠即时血糖的影响结果显示，与T2DM+生理盐水组相比,T2DM+FNDC5组在30min时血糖开始降低（P<0.05），到120min时下降到最低点（P<0.01）。随后血糖的水平逐渐回升，到210min时接近注射前的水平。3.长期FNDC5注射的结果显示，与Control组相比，T2DM组血脂、体重水平升高并出现葡萄糖耐量异常（P<0.05），给予FNDC5治疗后，血脂、体重水平下降，葡萄糖耐量得到改善。（P<0.05）。4.肝脏组织中G6Pase、PEPCK的检测结果显示，与Control相比，T2DM组肝脏中G6Pase、PEPCK的水平升高（P<0.05），给予FNDC5后， G6Pase、PEPCK水平下降（P<0.05）；肌肉组织中P-ACCβ的检测结果显示，与Control组相比，T2DM组骨骼肌中P-ACCβ水平下降（P<0.05），给予FNDC5后，P-ACCβ水平升高（P<0.05）。结论：1.本研究通过基因工程的方法成功表达出FNDC5蛋白，并通过在小鼠体内棕色脂肪UCP-1的检测确定了其生物学活性。2.FNDC5具有改善2型糖尿病小鼠糖脂代谢的作用，这可能与促进骨骼肌细胞β氧化及抑制肝脏糖异生有关。