重组灵芝锰过氧化物酶的研究与应用

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锰过氧化物酶(Manganese peroxida,MnP)是木质素降解的关键酶之一,底物专一性弱,具有氧化降解各类芳香族化合物的独特能力,在木质素降解、染料脱色等方面取得了较多的研究与应用。研究锰过氧化物酶的性质及应用,为推进锰过氧化物酶的大规模生产和环境应用奠定基础。首先,通过灵芝锰过氧化物酶重组毕赤酵母转化子的诱导表达,生产重组灵芝锰过氧化物酶(recombinant Ganderma lucidum manganese peroxidase,rGlMnP)的粗酶液,利用Brandford法测定蛋白浓度,并研究其酶学性质。结果表明上清液中总的蛋白约为3.3mg/mL。酶学性质研究结果表明,rGlMnP与底物作用的最适温度为30℃,最适pH为5.0,在pH3.0-6.0以及温度50℃以下,rGlMnP活力稳定。Ca2+、Mn2+、Na+、K+和Fe2+对rGlMnP活力有促进作用,Fe3+对其有抑制作用。其次,采用响应曲面法对重组毕赤酵母培养条件进行了优化,探讨不同pH、温度、甲醇和血红素浓度对rGlMnP毕赤酵母酶活力产生的影响。结果显示优化后的培养条件为:起始pH 5.7,温度为31℃,甲醇浓度为1.4%,血红素浓度1.0 mM。优化后rGlMnP的酶活力约为764.3U/L。另外,研究了rGlMnP毕赤酵母的粗酶液对4种染料Drimaren Blue CL-BR,Drimaren Yellow X-8GN,Drimaren Red K-4Bl和Disperse Navy Blue HGL的脱色效果。结果表明这四种染料脱色在90 min内的脱色率都达到70%左右。说明此实验中得到的rGlMnP具有较高的脱色能力。最后,尝试利用rGlMnP粗酶液对灵芝孢子粉进行破壁,利用显微镜观察其破壁效果,色谱法测定破壁孢子粉中多糖和三萜含量。显微镜观察经锰过氧化物酶处理的灵芝孢子粉破壁效果好。实验测得,经rGlMnP处理破壁后,灵芝孢子粉中的多糖含量较未添加酶液处理的提高了14.68%,三萜含量提高了14.22%。这说明添加rGlMnP酶液对孢子粉的破壁有显著的效果。
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