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背景立体定向消融放疗对组织的损伤形式是高剂量小范围的损伤,它对患者正常组织的损伤范围小且治疗次数少,现已广泛用于肺癌早期的治疗,但仍有约10%的患者会发生严重的放射性肺损伤,包括放射性肺炎和肺纤维化。GW5074是一种C-Raf的特异性抑制剂,它在小脑颗粒神经元等细胞中均可通过抑制C-Raf的活性而发挥相应的作用。但关于它与高剂量小范围放射性肺损伤的研究至今未见报道,本课题旨在阐明GW5074在高剂量小范围放射线诱导的肺泡上皮细胞间质转化中的作用及其机制。目的本研究采用高剂量放射线照射后的小鼠肺泡上皮细胞MLE-12和高剂量小范围放射线照射后的C3H/HeJCr小鼠作为研究对象,探讨GW5074在高剂量小范围放射线诱导的肺泡上皮细胞间质转化中的作用及其机制,为放射性肺损伤的防治提供新的策略。方法将90Gy的高剂量放射线以3mm的直径照射至C3H/HeJCr小鼠右肺,(1)通过蛋白芯片技术筛选出放射性肺损伤中变化最明显的蛋白质;并进一步经Western blot和免疫组化验证。用8Gy的X射线照射MLE-12细胞后,(2)应用Western blot分析在照射后各时间点C-Raf和p-C-Raf表达量的变化;(3)应用Western blot分析GW5074对C-Raf磷酸化的作用;(4)通过显微镜观察MLE-12细胞形态学的改变;(5)应用shRNA技术敲除该细胞中的Twist1基因,通过Western blot检测sh-Twist1对Twist1表达量的抑制作用。(6)应用Western Blot分析GW5074和sh-Twist1作用后p-C-Raf、Twist1、α-SMA和E-cadherin的表达情况。用75Gy的高剂量放射线以3mm的直径照射C3H/HeJCr小鼠右肺,照射后6周将小鼠处死,制备肺组织石蜡切片,(7)应用H&E染色分析小鼠肺损伤的程度;(8)应用免疫荧光双染法分析α-SMA和E-cadherin的表达水平。结果1激活态的C-Raf蛋白在放射性肺损伤中的变化程度最显著。为寻找HDSV放射性肺损伤中变化最大的功能蛋白,我们做了如下实验:将HDSV放射线照射至小鼠右肺,经过2周、4周以后,提取照射部位的肺组织蛋白,进行了protein arrays实验。我们发现磷酸化的C-Raf蛋白在照射后2周较对照组增加了1.309倍,且在4周后增加到2.028倍,我们进一步通过Western blot以及IHC结果证实了此结果的可靠性。2高剂量放射线照射后C-Raf、p-C-Raf在照射后各时间点的变化情况。高剂量放射线照射后MLE-12细胞中p-C-Raf的表达在照射后24h、48h、72h较对照组均有所增加(P<0.05),并且在48h增加最为显著(P<0.05),而照射后6h、12h细胞中p-C-Raf以及照射后各时间点C-Raf的变化较对照组均无明显变化(P>0.05)。因此我们选用照射后48h的时间点进行后续实验。3通过Western blot验证GW5074对p-C-Raf的作用。GW5074组较对照组明显抑制了C-Raf的激活(P<0.05),而DMSO组和对照组p-C-Raf的变化无统计学差异(P>0.05)。4通过显微镜观察高剂量放射线作用后MLE-12细胞形态学的变化。未经处理的MLE-12细胞显示出鹅卵石上皮细胞形态并能清楚地观察到细胞间的接触,但经放射线照射的细胞表现为纺锤体的间质细胞形态且细胞间的接触丢失。GW5074单独处理不改变细胞的上皮样结构,而在照射前用GW5074预处理有效地保护了上皮细胞免受照射引起的形态学变化。5应用短发夹RNA(shRNA)技术敲除细胞中的Twist1基因,通过Western Blot检测sh-Twist1对Twist1表达量的作用。sh-Twist1组较空载病毒(NC)组明显抑制了Twist1的表达(P<0.05),而NC组与对照组相比Twist1的表达无明显差异(P>0.05)。6通过Western Blot检测GW5074和sh-Twist1作用后p-C-Raf、Twist1、α-SMA和E-cadherin的表达情况。高剂量放射线照射后可明显激活C-Raf,并能使Twist1和α-SMA的表达量升高,E-cadherin的表达量降低。在照射前应用GW5074处理细胞,p-C-Raf、Twist1和α-SMA的表达量明显减少,而E-cadherin的表达量明显增加(P<0.05),而在照射前用sh-Twist1感染细胞,也能使Twist1和α-SMA的表达量明显减少,E-cadherin的表达量明显增加(P<0.05),而p-C-Raf表达量的变化与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。7通过H&E化学染色分析GW5074对HDSV放射线所造成小鼠肺损伤的作用。HE结果显示在HDSV放射线照射前用GW5074预处理的小鼠肺损伤程度较单纯照射组明显减小(P<0.05)。8通过免疫荧光染色分析肺组织中E-cadherin和α-SMA的表达水平。正常小鼠肺组织中E-cadherin以较高水平表达,而α-SMA仅以极低水平表达,在照射前用GW5074处理较单独照射组明显减少了α-SMA并增强了E-cadherin的表达(P<0.05)。结论1 激活态的C-Raf蛋白在放射性肺损伤中的变化程度最显著;2 GW5074可能通过抑制C-Raf/Twist1通路来有效地抑制HDSV放射线诱导的小鼠肺泡上皮细胞间质转化。