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第一部分NLRP3炎症小体在术后认知减退小鼠海马组织中的表达
目的：
探讨NLRP3炎症小体在术后认知减退(postoperative cognitive decline, POCD)小鼠中海马组织的表达情况。
方法：
C57BL/6J小鼠随机分成两组：对照组(C组)和手术组(S组)，每组各15只。C组小鼠未处理，S组小鼠接受七氟醚麻醉+剖腹探查手术，构建小鼠手术麻醉模型。各组在术后1、3、7天各取5只小鼠完成旷场试验和条件恐惧试验后断颈处死，将新鲜海马组织放置于-75℃冰箱中保存。利用Westernblot法检测海马组织中NLRP3，Caspase-1和ASC蛋白表达量。
结果：
1.旷场试验结果显示，与C组相比，术后1、3、7天S组在旷场试验箱中探索时总距离无明显变化(P＞0.05)；但在术后1、3天，S组小鼠在进入旷场中心区域的时间明显降低(P＜0.05)，而在术后7天，S组小鼠进入旷场中心区域的时间无明显改变(P＞0.05)。条件恐惧试验结果显示，在训练阶段，僵直时间比值方面，两组小鼠无统计学差异(P＞0.05)；在术后1、3、7天，与C组相比，S组小鼠僵直时间比值明显降低(P＜0.05)。
2.Westernblot结果显示，术后1、3、7天，与C组相比，S组小鼠海马组织中NLRP3蛋白表达量升高(P＜0.05)；在上述时间点，与C组相比，S组小鼠海马组织中NLRP3炎症小体相关蛋白Caspase-1和ASC表达水平明显升高(P＜0.05)。
结论：本研究结果提示剖腹探查加七氟醚麻醉会引起小鼠术后认知损伤，这可能与术后小鼠脑内海马组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达上调有关，其具体机制仍需深入探讨。
第二部分和厚朴酚活化海马组织SIRT3通路改善手术麻醉诱导的小鼠术后认知功能减退
目的：
观察和厚朴酚对POCD小鼠认知功能的影响，探究和厚朴酚对POCD小鼠海马组织中SIRT3表达情况以及对脑组织中氧化应激与神经炎症的影响。
方法：
1.C57BL/6J小鼠随机分成7组：对照组(Control组)，手术麻醉组(Surgery组)，手术麻醉+和厚朴酚组(S+HNK组)，手术麻醉+3-TYP组(S+3-TYP组)，对照+和厚朴酚组(C+HNK组)，对照+3-TYP组(C+3-TYP组)和手术麻醉+和厚朴酚+3-TYP组(S+HNK+3-TYP组)。Surgery组采用小鼠七氟醚麻醉+剖腹探查手术构建手术麻醉模型，对照组小鼠未接受手术。其余组小鼠在手术前7天，每日接受和厚朴酚腹腔注射，剂量为10mg/kg；或腹腔注射3-TYP每两日一次，每次剂量为50mg/kg。对照组小鼠每日腹腔注射给药等量(0.5 mL)0.5%二甲基亚砜，连续7天。在术后1、3天各组取6只小鼠先通过行为学测试，随后处死取材。
2.术后1，3天使用Westernblot检测海马组织中促炎性细胞因子和SIRT3/SOD2信号通路相关蛋白的表达。
3.在术后1天采用TUNEL法检测各组小鼠海马组织CA1和CA3区神经元凋亡程度；通过免疫组化法检测小鼠术后海马区SIRT3阳性细胞；免疫荧光法检测海马区Iba-1表达情况；利用JC-1法检测小鼠术后海马组织线粒体膜电位；使用相关试剂盒检测小鼠术后海马组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)和活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)水平。
结果：
1.旷场试验中，术后1，3天，手术+七氟醚暴露、和厚朴酚和/或3-TYP处理在旷场探索5min的总距离并没有显著差异(P＞0.05)；在术后1天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠其在旷场中心区域行走时间减少，而和厚朴酚干预组逆转了这一情况(P＜0.05)；术后3天，各组小鼠在旷场中心区域活动时间无显著差异(P＞0.05)。在场景恐惧试验中发现，在术后1天和3天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露可明显降低小鼠的僵直时间(P＜0.05)；和厚朴酚干预可以增加手术+七氟醚暴露引起的僵直时间减少(P＜0.05)；而3-TYP可以逆转和厚朴酚这种保护效应(P＜0.05)。
2.术后1，3天，海马组织促炎性细胞因子比较，与对照组相比，手术+七氟醚暴露可诱导小鼠海马组织TNF-α，IL-1β和MCP-1表达水平显著上调(P＜0.05)。此外，手术+七氟醚暴露处理增加了海马组织Iba-1的表达，提示手术+七氟醚暴露可以诱导小胶质细胞活化(P＜0.05)。与手术+七氟醚暴露组相比，和厚朴酚干预组可以显著抑制促炎性细胞因子表达，其海马区Iba-1表达也明显降低(P＜0.05)；而3-TYP则会逆转和厚朴酚的干预效果，TNF-α，IL-1β和MCP-1表达水平和小胶质细胞活化程度均有所升高(P＜0.05)。
3.术后1，3天Westernblot结果显示，与对照组相比，手术+七氟醚暴露降低了小鼠海马组织SIRT3蛋白的表达水平，上调了SOD2的乙酰化水平(P＜0.05)；与手术+七氟醚暴露组相比，和厚朴酚干预组小鼠海马组织SIRT3表达升高，Ac-SOD2的表达下调(P＜0.05)。而3-TYP处理则会降低海马组织中SIRT3的表达，增加了SOD2的乙酰化(P＜0.05)。免疫组化检测结果显示，与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠海马区SIRT3阳性免疫染色细胞明显下调(P＜0.05)；与手术+七氟醚暴露组比较，和厚朴酚干预组SIRT3阳性细胞数增加(P＜0.05)；而3-TYP处理组则抑制和厚朴酚的这种保护现象(P＜0.05)。
4.术后1天，手术+七氟醚暴露后小鼠海马组织CA1和CA3区神经元凋亡较对照组明显增加(P＜0.05)。和厚朴酚干预治疗可明显抑制手术+七氟醚暴露所致的凋亡指数升高(P＜0.05)，而腹腔注射3-TYP可增加术后1天海马CA1和CA3区神经元凋亡，消除和厚朴酚的神经保护作用(P＜0.05)。
5.在术后1天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露引起小鼠海马组织内ROS和MDA含量升高，同时出现线粒体膜电位(Δψm)降低(P＜0.05)。与手术+七氟醚暴露组相比，和厚朴酚处理逆转上述变化，(P＜0.05)。此外，手术+七氟醚暴露处理会显著增加小鼠海马组织中细胞色素C在胞浆中的表达(P＜0.05)，和厚朴酚使细胞色素C表达水平下调(P＜0.05)。然而，3-TYP处理可以抑制和厚朴酚的抗氧化作用和线粒体保护能力(P＜0.05)。
结论：
和厚朴酚可以通过激活SIRT3通路减轻小鼠海马组织线粒体功能障碍和神经炎症，有效改善手术+麻醉暴露诱导的小鼠认知功能下降。
第三部分和厚朴酚调控线粒体自噬改善手术麻醉诱导的小鼠术后认知功能减退
目的：
探究和厚朴酚对POCD小鼠海马组织中线粒体自噬以及对NLRP3炎症小体表达的影响。
方法：
1.C57BL/6J小鼠(排除行为异常或患有肿瘤)随机分成7组：对照组(Control组)，手术麻醉组(Surgery组)，手术麻醉+和厚朴酚组(S+HNK组)，手术麻醉+3-MA组(S+3-MA组)，对照+和厚朴酚组(C+HNK组)，对照+3-MA组(C+3-MA组)和手术麻醉+和厚朴酚+3-MA组(S+HNK+3-MA组)。Surgery组采用小鼠七氟醚麻醉+剖腹探查手术构建手术麻醉模型，对照组小鼠未接受手术。其余组小鼠在手术前7天，每日接受和厚朴酚腹腔注射，剂量为10mg/kg；或腹腔注射3-MA每两日一次，每次剂量为2mg/kg。对照组小鼠每日腹腔注射给药等量(0.5 mL)0.5%二甲基亚砜，连续7天。在术后1、3、7天各组取6只小鼠先通过行为学测试，随后处死取材。
2.术后1、3、7天使用Westernblot法和ELISA法检测海马组织促炎性细胞因子以及NLRP3相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白的表达情况。
3.在术后1天，采用TUNEL法检测各组小鼠海马组织CA1和DG区神经元凋亡情况；利用透射电镜观测线粒体超微结构变化；同时利用免疫组化法检测海马区NLRP3阳性细胞；免疫荧光法检测海马区LC3与Iba-1和NEUN共表达情况；利用相关试剂盒检测海马组织MDA和ROS水平。
结果：
1.在旷场试验中，在术后1、3、7天各组小鼠在旷场中总距离无明显差异(P＞0.05)。在场景条件恐惧试验中，术后1、3、7天各组间相关指标存在统计学差异。与对照组相比，接受七氟醚麻醉下手术的小鼠在术后7天内可减少情境恐惧反应的僵直时间(P＜0.05)。和厚朴酚可以改善手术应激引起的记忆损伤，增加了小鼠的僵直时间(P＜0.05)。然而，自噬和线粒体自噬抑制剂3-MA能减少和厚朴酚的保护作用(P＜0.05)。
2.与对照组相比，手术+七氟醚暴露能上调自噬相关蛋白LC-3Ⅱ和Beclin-1在术后1、3、7天的表达水平(P＜0.05)。与手术+七氟醚组相比，和厚朴酚预处理能进一步提高自噬生物标志物LC-3Ⅱ和Beclin-1的表达(P＜0.05)。而自噬抑制剂3-MA则会显著降低和厚朴酚引起的自噬增强效应(P＜0.05)。
3.在术后1、3、7天，与对照组相比，手术+七氟醚组小鼠PINK、Parkin蛋白表达明显升高(P＜0.05)，而和厚朴酚预处理会使PINK、Parkin蛋白表达进一步升高(P＜0.05)。而3-MA干预可以抑制线粒体自噬相关蛋白PINK和Parkin的上调(P＜0.05)。此外，和厚朴酚预处理则可明显降低手术七氟醚引起的ROS和MDA升高(P＜0.05)。而3-MA逆转了和厚朴酚带来的保护作用，引起ROS和MDA水平在7天内持续升高(P＜0.05)。与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠在术后1、3、7天海马组织中NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-1和IL-8的表达明显升高(P＜0.05)；接受和厚朴酚预处理的小鼠海马组织中NLRP3相关蛋白的表达明显低于手术+七氟醚暴露组小鼠(P＜0.05)；而3-MA干预会抵消和厚朴酚的保护作用(P＜0.05)。
4.在术后1天，Beclin-1可以表达于Iba-1(+)细胞和NeuN(+)细胞。与对照组相比，手术+七氟醚暴露可以促进Beclin-1在神经元和小胶质细胞表达，而和厚朴酚预处理会进一步增强海马区神经元和小胶质细胞中Beclin-1表达，3-MA抑制上述结果。
5.术后1天，利用透射电镜技术发现，与正常对照组相比，手术+七氟醚组出现严重的细胞损伤和线粒体损伤状况。和厚朴酚预处理缓解线粒体的损伤状态。然而，3-MA干预则消除了和厚朴酚对线粒体的保护作用。
6.术后1天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠其CA1和DG区TUNNEL阳性细胞明显增加，表明手术+七氟醚暴露会导致小鼠海马组织CA1和DG区神经元损伤增加。和厚朴酚预处理可以减轻小鼠手术麻醉模型中海马组织CA1和DG区神经元损伤(P＜0.05)。
结论：
和厚朴酚介导线粒体自噬可以改善手术/七氟醚引起的小鼠术后认知功能损伤。此类保护效应可能涉及减轻海马组织中NLRP3炎症小体的活化与炎症反应。
目的：
探讨NLRP3炎症小体在术后认知减退(postoperative cognitive decline, POCD)小鼠中海马组织的表达情况。
方法：
C57BL/6J小鼠随机分成两组：对照组(C组)和手术组(S组)，每组各15只。C组小鼠未处理，S组小鼠接受七氟醚麻醉+剖腹探查手术，构建小鼠手术麻醉模型。各组在术后1、3、7天各取5只小鼠完成旷场试验和条件恐惧试验后断颈处死，将新鲜海马组织放置于-75℃冰箱中保存。利用Westernblot法检测海马组织中NLRP3，Caspase-1和ASC蛋白表达量。
结果：
1.旷场试验结果显示，与C组相比，术后1、3、7天S组在旷场试验箱中探索时总距离无明显变化(P＞0.05)；但在术后1、3天，S组小鼠在进入旷场中心区域的时间明显降低(P＜0.05)，而在术后7天，S组小鼠进入旷场中心区域的时间无明显改变(P＞0.05)。条件恐惧试验结果显示，在训练阶段，僵直时间比值方面，两组小鼠无统计学差异(P＞0.05)；在术后1、3、7天，与C组相比，S组小鼠僵直时间比值明显降低(P＜0.05)。
2.Westernblot结果显示，术后1、3、7天，与C组相比，S组小鼠海马组织中NLRP3蛋白表达量升高(P＜0.05)；在上述时间点，与C组相比，S组小鼠海马组织中NLRP3炎症小体相关蛋白Caspase-1和ASC表达水平明显升高(P＜0.05)。
结论：本研究结果提示剖腹探查加七氟醚麻醉会引起小鼠术后认知损伤，这可能与术后小鼠脑内海马组织中NLRP3炎症小体相关蛋白表达上调有关，其具体机制仍需深入探讨。
第二部分和厚朴酚活化海马组织SIRT3通路改善手术麻醉诱导的小鼠术后认知功能减退
目的：
观察和厚朴酚对POCD小鼠认知功能的影响，探究和厚朴酚对POCD小鼠海马组织中SIRT3表达情况以及对脑组织中氧化应激与神经炎症的影响。
方法：
1.C57BL/6J小鼠随机分成7组：对照组(Control组)，手术麻醉组(Surgery组)，手术麻醉+和厚朴酚组(S+HNK组)，手术麻醉+3-TYP组(S+3-TYP组)，对照+和厚朴酚组(C+HNK组)，对照+3-TYP组(C+3-TYP组)和手术麻醉+和厚朴酚+3-TYP组(S+HNK+3-TYP组)。Surgery组采用小鼠七氟醚麻醉+剖腹探查手术构建手术麻醉模型，对照组小鼠未接受手术。其余组小鼠在手术前7天，每日接受和厚朴酚腹腔注射，剂量为10mg/kg；或腹腔注射3-TYP每两日一次，每次剂量为50mg/kg。对照组小鼠每日腹腔注射给药等量(0.5 mL)0.5%二甲基亚砜，连续7天。在术后1、3天各组取6只小鼠先通过行为学测试，随后处死取材。
2.术后1，3天使用Westernblot检测海马组织中促炎性细胞因子和SIRT3/SOD2信号通路相关蛋白的表达。
3.在术后1天采用TUNEL法检测各组小鼠海马组织CA1和CA3区神经元凋亡程度；通过免疫组化法检测小鼠术后海马区SIRT3阳性细胞；免疫荧光法检测海马区Iba-1表达情况；利用JC-1法检测小鼠术后海马组织线粒体膜电位；使用相关试剂盒检测小鼠术后海马组织中丙二醛(malondialdehyde, MDA)和活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)水平。
结果：
1.旷场试验中，术后1，3天，手术+七氟醚暴露、和厚朴酚和/或3-TYP处理在旷场探索5min的总距离并没有显著差异(P＞0.05)；在术后1天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠其在旷场中心区域行走时间减少，而和厚朴酚干预组逆转了这一情况(P＜0.05)；术后3天，各组小鼠在旷场中心区域活动时间无显著差异(P＞0.05)。在场景恐惧试验中发现，在术后1天和3天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露可明显降低小鼠的僵直时间(P＜0.05)；和厚朴酚干预可以增加手术+七氟醚暴露引起的僵直时间减少(P＜0.05)；而3-TYP可以逆转和厚朴酚这种保护效应(P＜0.05)。
2.术后1，3天，海马组织促炎性细胞因子比较，与对照组相比，手术+七氟醚暴露可诱导小鼠海马组织TNF-α，IL-1β和MCP-1表达水平显著上调(P＜0.05)。此外，手术+七氟醚暴露处理增加了海马组织Iba-1的表达，提示手术+七氟醚暴露可以诱导小胶质细胞活化(P＜0.05)。与手术+七氟醚暴露组相比，和厚朴酚干预组可以显著抑制促炎性细胞因子表达，其海马区Iba-1表达也明显降低(P＜0.05)；而3-TYP则会逆转和厚朴酚的干预效果，TNF-α，IL-1β和MCP-1表达水平和小胶质细胞活化程度均有所升高(P＜0.05)。
3.术后1，3天Westernblot结果显示，与对照组相比，手术+七氟醚暴露降低了小鼠海马组织SIRT3蛋白的表达水平，上调了SOD2的乙酰化水平(P＜0.05)；与手术+七氟醚暴露组相比，和厚朴酚干预组小鼠海马组织SIRT3表达升高，Ac-SOD2的表达下调(P＜0.05)。而3-TYP处理则会降低海马组织中SIRT3的表达，增加了SOD2的乙酰化(P＜0.05)。免疫组化检测结果显示，与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠海马区SIRT3阳性免疫染色细胞明显下调(P＜0.05)；与手术+七氟醚暴露组比较，和厚朴酚干预组SIRT3阳性细胞数增加(P＜0.05)；而3-TYP处理组则抑制和厚朴酚的这种保护现象(P＜0.05)。
4.术后1天，手术+七氟醚暴露后小鼠海马组织CA1和CA3区神经元凋亡较对照组明显增加(P＜0.05)。和厚朴酚干预治疗可明显抑制手术+七氟醚暴露所致的凋亡指数升高(P＜0.05)，而腹腔注射3-TYP可增加术后1天海马CA1和CA3区神经元凋亡，消除和厚朴酚的神经保护作用(P＜0.05)。
5.在术后1天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露引起小鼠海马组织内ROS和MDA含量升高，同时出现线粒体膜电位(Δψm)降低(P＜0.05)。与手术+七氟醚暴露组相比，和厚朴酚处理逆转上述变化，(P＜0.05)。此外，手术+七氟醚暴露处理会显著增加小鼠海马组织中细胞色素C在胞浆中的表达(P＜0.05)，和厚朴酚使细胞色素C表达水平下调(P＜0.05)。然而，3-TYP处理可以抑制和厚朴酚的抗氧化作用和线粒体保护能力(P＜0.05)。
结论：
和厚朴酚可以通过激活SIRT3通路减轻小鼠海马组织线粒体功能障碍和神经炎症，有效改善手术+麻醉暴露诱导的小鼠认知功能下降。
第三部分和厚朴酚调控线粒体自噬改善手术麻醉诱导的小鼠术后认知功能减退
目的：
探究和厚朴酚对POCD小鼠海马组织中线粒体自噬以及对NLRP3炎症小体表达的影响。
方法：
1.C57BL/6J小鼠(排除行为异常或患有肿瘤)随机分成7组：对照组(Control组)，手术麻醉组(Surgery组)，手术麻醉+和厚朴酚组(S+HNK组)，手术麻醉+3-MA组(S+3-MA组)，对照+和厚朴酚组(C+HNK组)，对照+3-MA组(C+3-MA组)和手术麻醉+和厚朴酚+3-MA组(S+HNK+3-MA组)。Surgery组采用小鼠七氟醚麻醉+剖腹探查手术构建手术麻醉模型，对照组小鼠未接受手术。其余组小鼠在手术前7天，每日接受和厚朴酚腹腔注射，剂量为10mg/kg；或腹腔注射3-MA每两日一次，每次剂量为2mg/kg。对照组小鼠每日腹腔注射给药等量(0.5 mL)0.5%二甲基亚砜，连续7天。在术后1、3、7天各组取6只小鼠先通过行为学测试，随后处死取材。
2.术后1、3、7天使用Westernblot法和ELISA法检测海马组织促炎性细胞因子以及NLRP3相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白的表达情况。
3.在术后1天，采用TUNEL法检测各组小鼠海马组织CA1和DG区神经元凋亡情况；利用透射电镜观测线粒体超微结构变化；同时利用免疫组化法检测海马区NLRP3阳性细胞；免疫荧光法检测海马区LC3与Iba-1和NEUN共表达情况；利用相关试剂盒检测海马组织MDA和ROS水平。
结果：
1.在旷场试验中，在术后1、3、7天各组小鼠在旷场中总距离无明显差异(P＞0.05)。在场景条件恐惧试验中，术后1、3、7天各组间相关指标存在统计学差异。与对照组相比，接受七氟醚麻醉下手术的小鼠在术后7天内可减少情境恐惧反应的僵直时间(P＜0.05)。和厚朴酚可以改善手术应激引起的记忆损伤，增加了小鼠的僵直时间(P＜0.05)。然而，自噬和线粒体自噬抑制剂3-MA能减少和厚朴酚的保护作用(P＜0.05)。
2.与对照组相比，手术+七氟醚暴露能上调自噬相关蛋白LC-3Ⅱ和Beclin-1在术后1、3、7天的表达水平(P＜0.05)。与手术+七氟醚组相比，和厚朴酚预处理能进一步提高自噬生物标志物LC-3Ⅱ和Beclin-1的表达(P＜0.05)。而自噬抑制剂3-MA则会显著降低和厚朴酚引起的自噬增强效应(P＜0.05)。
3.在术后1、3、7天，与对照组相比，手术+七氟醚组小鼠PINK、Parkin蛋白表达明显升高(P＜0.05)，而和厚朴酚预处理会使PINK、Parkin蛋白表达进一步升高(P＜0.05)。而3-MA干预可以抑制线粒体自噬相关蛋白PINK和Parkin的上调(P＜0.05)。此外，和厚朴酚预处理则可明显降低手术七氟醚引起的ROS和MDA升高(P＜0.05)。而3-MA逆转了和厚朴酚带来的保护作用，引起ROS和MDA水平在7天内持续升高(P＜0.05)。与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠在术后1、3、7天海马组织中NLRP3，ASC，Caspase-1，IL-1和IL-8的表达明显升高(P＜0.05)；接受和厚朴酚预处理的小鼠海马组织中NLRP3相关蛋白的表达明显低于手术+七氟醚暴露组小鼠(P＜0.05)；而3-MA干预会抵消和厚朴酚的保护作用(P＜0.05)。
4.在术后1天，Beclin-1可以表达于Iba-1(+)细胞和NeuN(+)细胞。与对照组相比，手术+七氟醚暴露可以促进Beclin-1在神经元和小胶质细胞表达，而和厚朴酚预处理会进一步增强海马区神经元和小胶质细胞中Beclin-1表达，3-MA抑制上述结果。
5.术后1天，利用透射电镜技术发现，与正常对照组相比，手术+七氟醚组出现严重的细胞损伤和线粒体损伤状况。和厚朴酚预处理缓解线粒体的损伤状态。然而，3-MA干预则消除了和厚朴酚对线粒体的保护作用。
6.术后1天，与对照组相比，手术+七氟醚暴露组小鼠其CA1和DG区TUNNEL阳性细胞明显增加，表明手术+七氟醚暴露会导致小鼠海马组织CA1和DG区神经元损伤增加。和厚朴酚预处理可以减轻小鼠手术麻醉模型中海马组织CA1和DG区神经元损伤(P＜0.05)。
结论：
和厚朴酚介导线粒体自噬可以改善手术/七氟醚引起的小鼠术后认知功能损伤。此类保护效应可能涉及减轻海马组织中NLRP3炎症小体的活化与炎症反应。