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金针菇是大型食用菌的一种,含有多种生物活性物质,多糖是其中所含有的最重要的活性物质之一。金针菇多糖(FVP:Flammulina velutipes polysaccharide)的生物活性被广泛的研究和报道,对于金针菇多糖抗肿瘤作用鲜见报道,且作用机制尚不明确。本实验室前期从金针菇子实体中分离得到金针菇多糖,并初步检测到具有对肝癌Hep G2细胞具有抑制作用。故本实验进一步研究金针菇多糖对Hep G2细胞增殖及诱导细胞凋亡作用及潜在的作用机制。为金针菇多糖抗肿瘤作用理论及作用机制的研究提供实验基础。实验方法:利用金针菇子实体中提取的75%、45%醇沉多糖及相应的除蛋白多糖FVP1、FVP2、FVP1a、FVP2a四种多糖,在不同浓度(0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L)及不同时间(24,48h)处理肝癌Hep G2,采用MTT法检测四种多糖对Hep G2细胞增殖抑制效果,以此为依据选择抑制增殖作用明显的FVP1多糖以及0μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L浓度作用24h、48h为后续实验条件。利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒法检测FVP1对肝癌细胞凋亡率的影响。利用Hoechst 33258荧光染色法检测FVP1处理Hep G2细胞后凋亡形态学变化。利用q PCR(实时荧光定量PCR)法检测凋亡相关基因Caspase-3、8、9、Bax、Bcl2 m RNA表达水平。利用试剂盒法检测凋亡蛋白Caspase-3、8、9活性变化。利用Western blot法检测凋亡相关Bcl2、Bax、PARP蛋白表达水平。实验结果:1 MTT实验结果所示四种多糖在实验浓度范围内及24、48h作用时间均对肝癌Hep G2增殖抑制作用,且呈浓度时间依赖关系。抑制效果FVP1>FVP1a>FVP2>FVP2a,即75%组分抑制效果好于45%组分作用效果,未除蛋白多糖作用效果好于除蛋白多糖作用效果。2 Annexin V-FITC/PI双染实验结果所示,与空白组相比,FVP1作用Hep G2细胞24h、48h后显著提高凋亡率(p<0.05),随着浓度增高凋亡率升高,且作用48h凋亡率高于24h。3 Hoechst33258荧光染色结果显示,随着FVP1浓度提高,FVP1使细胞核染色质呈现致密明亮蓝色浓染的细胞凋亡典型变化,且镜下观察到细胞数目随FVP1浓度增加而减少。4 q PCR结果显示,FVP1能够显著提高Caspase-9、Bax m RNA表达水平(p<0.05),作用趋势48h效果好于24h。FVP1能够提高Caspase-3、8、m RNA表达水平趋势,但作用效果不显著,FVP1对Bcl2 m RNA表达无明显影响。提示FVP1可能通过影响线粒体凋亡、及死亡受体途径诱导Hep G2细胞凋亡。5 Caspase蛋白活性实验表明,FVP1在实验浓度及时间范围内能够显著提高Caspase-3、8、9活性(p<0.05)。进一步证实Caspase-3、8、9蛋白在细胞凋亡过程中发挥作用。6 Westwrnblot实验结果显示,FVP1能够显著提高促凋亡蛋白Bax表达,显著抑制抗凋亡蛋白Bcl2表达水平、促进凋亡底物蛋白PARP剪切化水平。提示:FVP1通过影响线粒体凋亡途径关键蛋白Bax、Bcl2表达诱导细胞凋亡。综上所述:FVP1能够抑制肝癌细胞Hep G2增殖作用,通过促进线粒体途径中促凋亡蛋白Bax表达水平及m RNA水平,抑制抗凋亡蛋白Bcl2蛋白表达水平影响线粒体通透性,提高Caspase-9、3活性蛋白,促进凋亡底物PARP剪切诱导细胞凋亡。同时由于检测到Caspase-8活性蛋白提高,表明死亡受体途径也参与FVP1诱导细胞凋亡过程。证明金针菇多糖具有肝癌Hep G2细胞增殖和诱导细胞凋亡活性。更为具体的作用机制还需进一步研究。