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研究目的根据CRISPR-Cas9文库筛选方法,利用人类Gec KOv2(A)文库在CAL27细胞上进行全基因组顺铂耐药基因筛选。同时,用体外药物浓度递增法筛选培养出一株对顺铂耐药的CAL27/Cisplatin细胞,检测分析CAL27/Cisplatin和CAL27细胞在正常培养状态下和顺铂处理后各组细胞中mRNA表达谱差异。将CRISPR/Cas9文库高通量筛选数据与转录组测序数据进行联合生物信息学分析,最终筛选出在CAL27细胞顺铂耐药机制中起重要作用的关键基因,并初步验证其相关功能和机制,为后续进一步研究人口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)顺铂耐药机制及开发顺铂耐药逆转药物提供重要依据。研究方法1、将携带嘌呤霉素抗性的人类Gec KOv2(A)文库病毒感染CAL27细胞,嘌呤霉素抗性选择感染阳性细胞获得稳转细胞。再分别给予溶剂DMSO和药物顺铂进行阳性筛选,提取存活细胞的g DNA。PCR扩增包含g RNA的目的片段,高通量测序各组g RNA丰度变化,生物信息学分析确定具有显著差异的CAL27细胞顺铂耐药相关基因。2、体外药物浓度递增法筛选培养出一株对顺铂耐药的CAL27/Cisplatin细胞,分别对正常培养状态下的CAL27细胞、CAL27/Cisplatin细胞和顺铂处理后的CAL27细胞、CAL27/Cisplatin细胞进行转录组测序,生物信息学分析转录组测序数据,筛选出与顺铂耐药相关的差异表达基因。3、CRISPR/Cas9文库高通量筛选数据与转录组测序数据联合分析,最终甄别出在CAL27细胞顺铂耐药机制中起重要作用的关键基因。4、通过CAL27细胞及动物实验对筛选出的关键基因作初步功能和机制验证。研究结果1、通过CRISPR/Cas9文库高通量测序筛选,共获得112个CAL27细胞对顺铂耐药相关候选基因。其中与顺铂耐受相关候选基因有ERCC8、SMEK1、PVRL3、PPP4R2、UVSSA、ZNF98、SLFN12L、PCDHGB2、HTRA1和C12orf42等13个,与顺铂敏感相关候选基因有PMVK、EXOSC3、DHRSX＿X、PPP1R35、C16orf59、ATP5I、C18orf21、AASDHPPT、IRF7和NMD3等99个。2、体外药物浓度递增法筛选出顺铂耐药CAL27/Cisplatin细胞株,并培养成功。3、通过转录组测序筛选,共获得25个对顺铂耐药相关候选基因。这25个候选基因都表现为,在顺铂处理后的CAL27/Cisplatin细胞中相对低表达、CAL27细胞中相对高表达,而在正常培养状态培养下的CAL27/Cisplatin和CAL27细胞中表达无明显差异。4、CRISPR/Cas9文库高通量测序筛选数据与转录组测序数据联合分析,最终筛选出的IRF7基因是CAL27细胞在顺铂耐药机制中起重要作用的关键基因。5、细胞功能实验和动物实验初步证明,敲减IRF7表达可以降低CAL27细胞对顺铂敏感性,产生顺铂耐药。研究结论本课题研究发现IRF7基因是OSCC在顺铂耐药机制中起重要作用的关键基因。敲减IRF7表达可以降低CAL27细胞对顺铂敏感性,产生顺铂耐药。因此,IRF7有望成为预测人OSCC顺铂耐药的标志物以及逆转人OSCC顺铂耐药潜在的治疗靶点。