胸膜肺炎放线杆菌(A ctinobacillus pleuropneumoniae, APP)是引起猪胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)的病原菌,该病是一种严重的猪呼吸道疾病且具有致死性,给养猪业造成了极大的经济损失。到目前为止,已经发现了15种APP血清型。APP的感染以及致病过程中有许多毒力因子的参与,包括RTX毒素、荚膜多糖、脂多糖、粘附因子、蛋白酶、外膜蛋白以及转录调控因子等。本实验通过多种生物信息学分析软件,预测发现APP中共有60种脂蛋白,并从中挑选出一个具有特殊串联重复序列Q(E/D/P)QPK的脂蛋白Lip40。统计发现不同血清型APP菌株中,该重复序列的重复次数不同。通过BioEdit (7.0 版)对Lip40蛋白进行多序列比对分析发现,其与多种已知的脂蛋白和Tbp蛋白具有较高的相似性|。利用SWISS-model对其三维结构进行预测分析,结果显示Lip40蛋白由1个p筒(该β筒由8条p折叠构成)以及4条p折叠所构成,并通过WinCoot软件将Lip40蛋白分别与APP TbpB N lobe、C lobe进行三维结构重叠比对,发现Lip40蛋白与两者的三维结构都具有较高的相似性。为了获得重组Lip40蛋白,本研究首先通过PCR克隆到APP SLW01菌株中的lip40基因,目的基因经限制性内切酶酶切后,连入pGEX-KG载体,转化E.coli BL21感受态细胞,经IPTG诱导获得重组蛋白rLip40。经免疫印迹分析,rLip40泳道上出现一个分子量约为56 kDa的杂交带,表明抗APP的阳性血清可以特异性的识别并结合rLip40蛋白,说明rLip40蛋白具有较好的免疫反应性。另外,本研究以rLip40蛋白为免疫原免疫大白兔,获得兔抗rLip40多克隆抗体,其效价可达1：2×105,表明rLip40蛋白可以诱导动物机体产生较强的免疫反应,说明Lip40蛋白具有良好的免疫原性。为鉴定Lip40蛋白的亚细胞定位,本研究分别提取APP各亚细胞蛋白组分,以兔抗rLip40蛋白多克隆抗体为一级抗体,通过免疫印迹方法对Lip40蛋白进行亚细胞定位,结果发现其定位于外膜,与之前生物信息学结果相同。之后本研究分析了Lip40蛋白在不同应激条件下的表达情况,结果显示在高温、厌氧和低温等应激条件下,Lip40蛋白在转录水平上和翻译水平上均呈现上调,故认为Lip40蛋白是一个多重应激响应因子,并推测Lip40蛋白可能是APP的毒力因子,可能参与病原菌-环境以及病原菌-宿主之间的相互作用。本研究分析了Lip40蛋白的免疫保护性,以rLip40蛋白为免疫原,免疫小鼠,随后以致死剂量的高致病性APP菌株攻毒,结果表明Lip40蛋白对小鼠的保护率达到75%,虽然其保护率低于ApxIA毒素蛋白(100%)和灭活疫苗(91.7%),但显著高于空白对照组。因此,Lip40蛋白可以作为高效APP疫苗研发的候选蛋白。本研究还以前期构建的lip40基因缺失突变株△lip40为亲本,成功构建了回复突变株CΔlip40,并对其生物学特性进行了初步分析。穿梭质粒pJFF-lip40可在APP中稳定遗传,并且未对APP生长能力造成显著影响。此外,APP SLW01菌株和△lip40对氯霉素高度敏感,但回复突变株CAlip40较前两种菌株对氯霉素抗性明显增强,表明穿梭质粒pJFF224-XN抗性基因可在APP菌株中稳定表达。回复突变株CΔlip40的成功构建为分析Lip40蛋白的致病机制提供了有效材料,本实验中建立的APP互补菌株构建系统以及APP抗性评价方法将有助于今后研究APP生物学特性及基因功能。