目的：CD4+CD25+调节性T细胞通过负性调节免疫反应在维持免疫系统的平衡中发挥重要作用，因此该类细胞在移植、自身免疫和肿瘤等方面都有潜在的应用价值，虽然在各个领域中研究和应用的目的不同。就移植免疫而言，使用尽可能少甚至不用免疫抑制剂达到对主要和次要组织相容性复合体不同异体组织或器官的长期耐受一直都是被追求的理想目标。天然存在的调节性T细胞数量稀少仅占CD4+细胞的5-10％，使其成为治疗应用的主要障碍，为了克服这一困难，人们研究了通过体外扩增天然调节性T细胞来增加数量，但其不足在于来源匮乏和耗时较长。而CD4+CD25-T细胞在外周单个核细胞所占比重较高，在肿瘤相关的研究中表明肿瘤来源的可溶性因子可以将CD4+CD25-T细胞转化为调节性T细胞。提示我们这有可能是一条获得治疗水平的应用于同种移植中调节性T细胞的一条新途径，目前尚无相关报道。本文即利用小鼠肾癌细胞系Renca细胞的条件培养基通过体外和体内实验对此做了探讨。　　 方法：　　 ⑴Renca细胞株购自中山大学医学院动物实验中心，BALB/c小鼠和C57BL/6(B6)小鼠，由中山大学眼科医院实验动物中心提供。所用各品系小鼠均为雄性，体重20±2g。　　 ⑵在10％FBS+RPMI1640的培养基中传代培养小鼠肾癌细胞株Renca，待细胞生长至80％时，换用无血清RPMI1640的培养基继续培养72h，收集上清夜，1500rpm离心5 min，取上清超滤除菌，保存于-70℃冰箱中备用。　　 ⑶断颈处死BALB/c小鼠，取脾脏，Ficoll分离获得单个核细胞；通过小鼠CD4+T细胞磁珠分离试剂盒，阴性选择获得CD4+T细胞；再次阳性选择获得CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞，通过流式细胞仪(BD FACS Calibur)分析细胞纯度。其中后者作为细胞转化培养用；前者用作阳性对照细胞。　　 ⑷Foxp3 mRNA Real Time RT-PCR检测培养终点收集细胞加入1ml Trizol试剂。匀浆后，用氯仿进行二相分离，溶解至水相的RNA用异丙醇沉淀，离心后清洗RNA沉淀。标本RNA反转录，合成cDNA。标本的目的基因和管家基因分别进行Real time RT-PCR反应。反应条件：95℃预变性10 s，Foxp3为40个PCR循环(95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s)，GAPDH为40个PCR循环(95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s)。荧光定量结果以Foxp3/GAPDH的CT比值表示。　　 ⑸细胞因子等效性实验根据初始条件培养基中所含IL-10和TGF-β浓度，换算出转化培养细胞时各组相应的终浓度，分别加入重组的小鼠IL-10和TGF-β，使孔内这两个细胞因子的终浓度与转化培养时相同，加入与方法4同等量的抗小鼠CD28、IL-2，混匀后放入37.0℃、5％CO2、95％湿度条件培养箱中培养；在培养的第4、第6d半量换液，换除培养基以1200rpm离心5min，加入含同样浓度细胞因子，加入各孔混匀继续培养，第7天收集细胞。同1.4方法检测细胞表型。　　 ⑹以Balb/c小鼠脾细胞作为反应细胞，以C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞。经25μg/ml的丝裂霉素灭活刺激细胞。反应和刺激细胞均调整浓度为1×106/ml。刺激细胞与反应细胞按1∶1比例进行混合淋巴细胞培养。在培养体系中加入经转化培养后再次分选的CD4+CD25+FoxP3+T细胞，与反应细胞的比例分别为4∶1，0∶1，1∶1和1∶4，混匀后在培养箱中培养72h，加入CCK-8后继续培养6-8h后，酶标分析仪检测在450nm波长的吸光度。　　 ⑺组织病理学检查和免疫组织化学染色于术后第10 d取皮肤移植物及周围组织，用10％甲醛固定后行石蜡包埋、切片及HE染色，在光学显微镜下观察各组标本的组织病理学改变。将石蜡包埋的移植物组织切成5μm厚的切片，脱蜡至水，经消除内源性过氧化物酶及抗原复性处理后，进行免疫组化染色。染色参照免疫组化二步法试剂盒说明书操作，苏木素复染后封片。显微镜400倍率下，在每张切片中随机选择5个视野计数Foxp3阳性细胞，换算为阳性细胞数/mm2进行评价。　　 ⑻使用SPSS11.0软件进行统计分析。所有实验数据均以X±s表示，组间差异的多重比较采用One-way ANOVA检验。移植皮瓣生存时间采用采用Kaplan-Meier生存曲线分析并用秩和检验(1og-rank test)检验。检验水准a=0.05，即p＜0.05为差异具有显著性。　　 结果：　　 ①取BALB/c小鼠的脾细胞，采用MACS方法分选CD4+CD25-T细胞，分选后经流式细胞仪鉴定其纯度＞88％。CD4+CD25-T细胞培养5 d后上机检测。结果发现在一定比例范围(3∶1)内随着R-CM的比例增加，CD4+CD25+Foxp3+T细胞在培养体系中所占的比例也相应增加，在含75％的R-CM中达到最高，CD4+CD25+T细胞和CD4+Foxp3+T细胞分别为(21.52±1.88)％和(11.85±0.82)％，然而在完全R-CM中培养体系中CD4+CD25+和CD4+Foxp3+T细胞的比例又呈下降趋势它们分别是(16.47±1.56)％和(5.52±0.35)％，但仍高于无R-CM的培养体系中的比例(P＜0.05)。　　 ②培养的淋巴细胞Foxp3基因的表达随着条件培养基在混合培养基中的比例增加，FoxP3的表达水平逐渐增加，而在含有75％的Renca条件培养基中培养的CD4+CD25-T细胞该基因表达水平最高，与对照培养基中培养的细胞相比有明显差别(p＜0.05)，随后在完全Renca条件培养基中细胞该基因的表达又呈较低水平。　　 ③培养基中相同浓度的重组IL-10和TGF-β诱导转化的调节性T细胞百分比低于对应的条件培养基组结果显示在对应的含有相同浓度的重组IL-10和TGF-β各培养组CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞和CD4+FoxP3+T细胞的百分率分别是(4.24±0.20)％、(5.28±0.57)％、(6.88±0.41)％和(9.07±0.40)％及(1.83±0.06)％、(2.02±0.70)％、(2.04±0.78)％和(4.21±1.12)％，明显低于对应于RPMI1640：Renca条件培养基分别为3∶1、1∶1、1∶3和0∶1的各培养组的各组结果(p＜0.05)。　　 ④将被转化的调节T细胞按不同比例加入单向混合淋巴细胞培养体系。结果显示：随着参与共培养的转化性调节性T细胞的比例增加(0∶1、4∶1、1∶1和1∶4)，各组细胞的吸光度逐渐降低，在0∶1组为0.71±0.036，在1∶4组则为0.2±0.049，表明该细胞能降低反应性T细胞的增殖能力，并且呈比例依赖性，各组相比P＜0.05。　　 ⑤从每组小鼠中各取8只用于记录生存时间并绘制生存曲线，结果显示：无论是在转化的调节性T细胞处理组(29.6±1.4 d)还是新鲜分离的调节性T细胞处理组(28.0±1.0 d)，其受体小鼠的皮肤移植物的存活时间均明显长于未处理组(9.8±0.6 d)和PBS处理组(10.9±0.6 d)(P＜0.05)，甚至长于雷帕霉素组(19.9±0.6 d)(P＜0.05)，而转化的调节性T细胞处理组和新鲜分离的调节性T细胞处理组在移植物存活时间方面无明显差异(P＞0.05)，在同系同基因移植组，移植皮片均永久存活。　　 ⑥在皮肤移植后第15 d对受体两足掌肿胀度测量的结果显示：转化的调节性T细胞处理组的小鼠对供体C57BL/6脾细胞反应(0.29±0.071 mm)与未处理组(1.04±0.075 mm)和PBS处理组(1.00±0.122 mm)相比明显较轻微(P＜0.05)，与天然的调节性T细胞处理组(0.29±0.035 mm)相似，而雷帕霉素处理组受体足掌的肿胀度介于两者之间(0.42±0.1 mm)。　　 ⑦在术后第10 d取受体移植皮片及其周围组织进行病理组织学观察。镜下可见在未处理组和PBS处理组移植物表皮层坏死，真皮层结构紊乱，前者弥漫性淋巴细胞浸润，后者见胶原纤维坏死，未见毛囊及血管结构。雷帕霉素组皮下组织及毛囊周围淋巴细胞细胞浸润明显，部分胶原纤维排列紊乱，表皮脱落，表明能抑制局部排斥反应。在其余3组可见完整的表皮及真皮结构，其中在转化的调节性T细胞处理组可见到较为密集的小血管和少量的淋巴细胞浸润，以毛囊周围较明显，其表现与同系同基因移植组相似，而在天然调节性T细胞处理组仍可见到较多的淋巴细胞浸润。　　 结论：⑴Renca条件培养基能诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+调节性T细胞，这种转化作用是通过Renca细胞所产生的包括IL-10和TGF-β在内的多因子的协同作用实现的；⑵转化的CD4+调节性T细胞在体外能抑制反应性T细胞对抗原刺激的反应能力，在体内能移植同种移植免疫反应；⑶诱导转化的CD4+调节性T细胞是获得足够数量调节性T细胞的的有效途径，可以在同种移植中用于细胞免疫治疗。