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众多农作物都面临着虫害的威胁,我国每年因为虫害威胁而损失的植物总量较大。据报道,虫害每年我国的农作物造成的损失高达近500亿斤。烟草(Nicotiana tabacum)作为一种重要的模式植物而被广泛用来研究植物与昆虫互作关系,以烟草为模式植物来研究植物的抗虫机制,对于培育抗虫农作物品种具有重要的理论及实践意义。目前我国针对农作物虫害的防治仍然以化学防治为主,生物防治为辅的状况。但这些防虫措施,尤其是化学防治,不仅给我们环境带来了严重的污染,而且也使害虫产生强烈的耐药性。尽管生物防治不会造成环境污染,但是防治害虫所用的性信息素一方面合成较为困难,另一方面性信息素较为特异,往往一种害虫对应一种性信息素,这也极大的限制了它的应用。通过基因工程培育抗虫害植物品种是伴随着分子生物学手段的进步而出现的一种比较理想的防治害虫的措施。近年来,最先出现的是利用Bt毒蛋白制备的抗虫转基因植株,虽然防治害虫的效果较好。但是,随着Bt作物的种植,害虫对Bt耐受性逐年增强。挖掘植物抗虫相关负调控因子,通过基因工程手段失活或调低对应基因进而培育抗虫品种是被认为是未来作物抗虫分子育种有一定潜力的方向。本项研究以栽培烟草作为研究载体,筛选获得抗虫候选负调控因子Cytochrome P450(NtCYP450)和Jasmonoyl-L-isoleucine hydrolase 1(NtJIH1),通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除NtCYP450和NtJIH1,获得了对应的突变株系。扩大培养突变株系,对其抗虫性能及相关生理生化指标进行了检测。本研究主要取得了以下研究结果:1.NtJIH1及NtCYP450的鉴定及表达模式分析通过同源序列比对,在烟草红花大金元品种中共鉴定获得15个JIH1基因(NtJIH1-1~NtJIH1-15)及3个与抗虫负调控候选CYP450基因(NtCYP450-1,NtCYP450-2和NtCYP450-3)。对于NtJIH1基因家族而言,在烟草红花大金元中共鉴定到15个JIH1基因,进化树结果表明,其可被分为8个分支;多序列比对结果表明其主要包含C(半胱氨酸),E(谷氨酸),H(组氨酸)等活性位点,而且NtJIH1-1和NtJIH1-2这两个基因与二倍体烟草中已报道的抗虫负调控基因基因NaJIH1最为接近;基因结构结果表明多数NtJIH1基因包含5个外显子,并且存在成对基因的结构较为类似的现象。对于NtCYP450基因而言,我们共鉴定获得与已报道抗虫负调控CYP450基因(登录号:AF166332)最为接近的基因三个,分别将其命名为Nt CYP450-1,NtCYP450-2和Nt CYP450-3,这些基因位于CYP45071家族的第14分支;其活性区域预测结果显示,保留了P450 domain区域,暗示了其在进化上高度保守;芯片数据结构显示,多数NtCYP450基因在各组织中的表达模式较为接近。棉铃虫取食诱导表达谱显示,多个NtJIH1基因,在6h时,表现出被明显上调的表达模式,包括NtJIH1-1/2,-4,-5,-7,-9/10,-11,-12和-13;NtCYP450-1,NtCYP450-2和NtCYP450-3均能够在棉铃虫取食下被明显上调表达。桃蚜取食诱导表达谱显示,Nt JIH1基因家族中多个基因在6h时,表现出被明显上调的表达模式,包括NtJIH1-1/2,-3,-4,-5,-6,-7,-9/10,-12和-15;对于NtCYP450基因而言,Nt CYP450-1,NtCYP450-2和NtCYP450-3在桃蚜取食下被明显上调表达。这些结果初步显示本研究筛选获得的NtJIH1和NtCYP450可能与烟草抗虫密切相关。2.NtJIH1及NtCYP450的过表达及敲除通过CRISPR/Cas9基因编辑技术及转基因过表达技术,获得了NtJIH1-1,NtJIH1-2,NtCYP450-Target1及Nt CYP450-Target2的敲除突变体植株和NtCYP450-2及NtJIH1-1的后代转基因过表达植株。目前,NtJIH1两个基因的突变株均已获得纯合植株,而NtCYP450的两个共同靶位点植株已经获得T1代杂合植株,这些突变体的突变形式以碱基的删除,插入及缺失为主。对NtJIH1-1和NtJIH1-2的部分CDS的PCR扩增比较结果表明,NtJIH1-2基因在烟草体内表达量很低。对获得的基因编辑突变株的防御相关基因进行荧光定量PCR检测,结果显示,除了NtJIH1-2纯合突变体外,其他突变株其多数防御相关基因均呈现显著上调表达趋势,如Jasmonic acid(JA)信号通路的标记基因PR1b(pathogenesis-related protein1b precursor),Salicylic acid(SA)信号通路中的标记基因PR1a/c(pathogenesis-related protein 1 a/c)、PR2(pathogenesis-related protein 2)和CHN50(endochitinase B),Ethylene(Eth)信号通路基因标记基因ACC OXidase和EFE26(ethylene-forming enzyme),Hypersensitive response(HR)信号通路标记基因HSP201(heat shock protein)和HIN1(Harpin-induced gene 1)及Reactive oxygen species(ROS)信号通路标记基因GST1(Glutathione S-transferase)等均能够显著上调表达。3.NtJIH1及NtCYP450突变体的抗虫检测及抗性指标检测扩大培养获得的NtJIH1及NtCYP450的敲除突变株系,分别施加棉铃虫及蚜虫,检测突变株系对咀嚼式昆虫及刺吸式昆虫的防御能力进行比较检测。结果显示,与非突变株系相比,取食NtJIH1-1 T1代和T2代突变株的棉铃虫,在取食4天后,其体重分别减少约40%和60%。实验结果也表明与对照植株相比较,植物胰蛋白酶抑制剂和胼胝质含量均有显著提高,说明这种抗性的产生可能与植物胰蛋白酶抑制剂和胼胝质的形成有关。对NtJIH1突变株添加桃蚜进行抗虫性检测,结果显示,与非突变株系相比,取食NtJIH1突变株的桃蚜,10天后其子代数量并没有显著性变化。类似的抗虫性能检测实验显示NtJIH1-2突变株不具备明显的抗虫性能。究其原因,我们发现NtJIH1-1和NtJIH1-2基因中分别来源于二倍体祖先种S基因组(Nicotiana sylvestris)和二倍体祖先种T基因组(Nicotiana tomentosoformis),而与Nt JIH1-1相比,根据CDS扩增片段克隆数测序比例估算NtJIH1-2的表达量为NtJIH1-1的七分之一左右,我们推测在异源四倍体烟草重组过程中,这两个基因进行了功能选择性进化,导致其突变体并没有发挥抗虫的作用。此外,我们发现NtJIH1-1的纯合突变体相较于对照而言,虽然有抗虫作用,但其生长缓慢,显著变小,而初步推测其可能与JA信号通路中Jasmonate ZIM-domain(JAZ)基因的调控相关。我们也对NtCYP450的突变株的抗棉铃虫及蚜虫性能进行了检测。结果表明,与非突变株系相比,取食两株NtCYP450 T1代突变株的棉铃虫,在取食4天后,其体重分别减少约49.5%和24%。实验结果也表明与对照植株相比较,胼胝质含量有显著提高,说明这种抗性的产生可能与胼胝质的形成有关。对NtCYP450突变株添加桃蚜进行抗虫性检测,结果显示,与非突变株系相比,取食两株NtCYP450突变株的桃蚜,10天后其子代数量分别减少57%和46%。而在突变株中,我们发现乙烯的含量与对照相比较,其含量增多,说明这种抗性的产生可能与乙烯诱导的防御相关。本项研究通过基因编辑CRISPR/Cas9技术,获得了Nt JIH1-1,NtJIH1-2,NtCYP450-Target1和NtCYP450-Target2的突变体。实验结果表,Knockout-NtJIH1-1植株表现出对棉铃虫具有显著增强的抵抗能力,而Knockout-NtCYP450-Target1和Knockout-NtCYP450-Target2植株表现出对棉铃虫和桃蚜均具有显著增强的抵抗能力。