论文部分内容阅读
口蹄疫对我国养殖业造成严重威胁,由于传统灭活疫苗存在病毒毒力返强、灭活不彻底等不安全因素,促使人们研究更加安全的口蹄疫疫苗。PPV-VLPs亚单位疫苗具有类似天然病毒的稳定性和免疫原性,不具有病毒核酸,没有感染性,因此具有很好的应用前景。本研究以P1代重组病毒为材料,研究重组病毒增值工艺,利用杆状病毒表达系统,研究重组蛋白最适表达条件及免疫原性,以期研发出廉价、高效、安全的PPV-VLPs亚单位疫苗。本文通过对比昆虫细胞悬浮培养和贴壁培养2种方式下的细胞形态,研究昆虫细胞的最佳培养方式;通过用血球计数板每隔24h进行细胞计数,绘制悬浮细胞复制动力学曲线,研究昆虫昆虫细胞生长周期。为了得到高滴度的P3代重组病毒,将P1代重组病毒转染昆虫细胞,PCR鉴定插入的外源基因是否丢失;Western-blotting检测重组蛋白表达及其反应原性;采用不同的MOI感染昆虫细胞,不同时间收获病毒,通过测定病毒度,研究重组病毒增值工艺。采用不同的MOI感染昆虫细胞,不同感染时间收获细胞沉淀,进行Western-blotting分析,用软件对比灰度值,研究重组蛋白最适表达条件。采用最佳重组蛋白表达条件感染大量的悬浮昆虫细胞,进行重组蛋白的大量表达,将粗纯的蛋白表达产物加佐剂乳化肌肉注射豚鼠,采集血清,用间接ELISA方法检测抗体水平。结果表明,(1)昆虫细胞的最佳培养方式是悬浮培养;(2)为了得到高滴度的P3代重组病毒,PCR鉴定插入的外源基因没有因为传代而丢失;(3)研究重组病毒增值工艺,得出最佳MOI是0.05个MOI,最佳感染时间是72h;(4)重组蛋白在昆虫细胞中获得较好的表达,Western-blotting分析结果表明重组蛋白的反应原性良好,同时进一步证明了插入的口蹄疫病毒中和表位的存在;(5)研究重组蛋白最适表达条件,Westernblotting分析结果表明最适条件是10个MOI,最佳感染时间72h;(6)间接ELISA方法检测结果表明,灭活疫苗组和空衣壳免疫组都产生了较低水平的FMDV中和抗体和较高水平的PPV特异性抗体。(7)用SPSS软件对间接ELISA结果进行统计学分析,进一步验证了PPV空衣壳免疫原性。