1、背景大麻类植物是人类最早认识的成瘾性植物之一,使用大麻来止痛的记载可以追溯到数百年之前。最近十几年,随着内源性大麻素(endogenous cannabinoids, EC)的发现,以及两种内源性大麻素受体(cannabinoid type1receptor, CB1和cannabinoid type2receptor, CB2)的成功克隆,内源性大麻素系统(endocannabinoid system,ECS)的存在已经获得初步证实。CBl、CB2受体都属于G蛋白偶联受体,CBl受体由473个氨基酸,7个跨膜结构域构成。研究发现CBl受体主要分布于神经系统,以脑组织中表达为主,集中分布在大脑的海马、小脑和纹状体,多定位于神经末梢突触前膜,发挥调节神经递质释放的作用。在肾上腺,,心脏,肺,前列腺,脾脏和扁桃体等外周组织中也有微量表达。CB2受体由360个氨基酸,7个跨膜结构域构成,与CBl受体相反,CB2受体在中枢神经元中浓度很低,其主要在免疫系统中存在,包括脾脏、T细胞、扁桃体、B细胞及单核细胞中表达,主要发挥免疫调节作用,并能够抑制多种神经递质和细胞因子的释放。有研究表明CBl受体的拮抗剂可以增强对有害刺激的敏感性,且能够增强疼痛性神经元的活性。另外,CBl受体的激动剂可以抑制疼痛神经元的兴奋性,并且能够产生良好的镇痛效应。相关研究还表明CBl受体能够减少伤害性疼痛,从而抑制自发性疼痛的相关行为。原发性三义神经痛(Trigeminal neuralgia, TN)是一种神经慢性疾病,为三叉神经的分支分布区域里反复发作的刀割样阵发性的剧痛,其特点为三叉神经在口腔颌而部的某一分支或者几个支分支分布区域内突发的短暂而剧烈疼痛,并可长期的固定在某一分支,尤以第二、三支多见,亦可几支同时受累,持续疼痛时间为数秒钟到数分钟不等,而间歇期可以没有任何症状,其发作为自发性或由面部、口腔内轻微的触觉刺激所诱发,大多数是单侧发病,其中又以中老年人好发。目前,TN的发病机制尚不明确,确切的动物模型还难以建立。国内外学者大多认为TN的主要发病因素是周围因素,其中的血管压迫学说得到大多数学者的亲睐,所以,TN的动物模型基本上是通过眶下神经(infraorbital branch of the trigeminal nerve, ION)环扎术来模拟血管压迫现象,并且在ION支配区域的表面皮肤进行外在的机械性刺激,以此模拟TN扳机点来获得。三义神经脊束核(Spinal trigeminal caudal subnucleus, Vc)从外到内分为五层,在三叉神经脊束的内侧和延髓的外侧。Vc也是口腔颌面部组织的伤害性刺激向中枢传导的第一道门户,其尾侧亚核及其临近区域是躯体感觉的初级感受中枢,传递口腔颌面部的伤害性刺激信息。Vc的尾侧亚核在细胞构筑上相当于脊髓后角Ⅰ～Ⅵ层。Vc也被认为是面部伤害性传导通路的二级神经元所在区域,其与痛觉冲动的传递和调制有着密切的关系。Vc的Ⅱ层中胶状质中间神经元发生变性,便丧失了对传入的疼痛刺激的调节作用,失去了其对传入冲动的闸门作用,传入冲动可以很快达到一定的总和而引起疼痛剧烈发作。因此我们采用Vc组织来检测CBl受体的表达变化。有研究表明,损伤大鼠和猴子的外周神经,其存在于脊髓及背根神经节神经元中的μ阿片受体表达发生下降。而在坐骨神经(CCI)后的大鼠模型的同侧背角的表浅脊髓中CBl受体的表达同损伤大鼠单侧神经后的对侧丘脑区域内CBl受体的表达均发生上调。Nomura等和我们的研究团队的研究也都发现,对横断单侧下牙槽神经的大鼠鼻口部进行有害和无害的机械性刺激,则Fos和cdk5/p35蛋白样免疫反应性在其两侧Vc组织中均可被诱导,并且横断的对侧少于横断侧。Vc作为感觉中继站核,分别接受经三义神经传入的头而部感觉信息。坐骨神经CCI之后CBl受体表达发生上调的机制仍不明了,但是在该模型中,脊柱CBl受体的表达可能受到蛋白激酶C、酪氨酸激酶受体和相关的细胞内丝裂原活化蛋白激酶的调控。该模型的病理学特征与眶下神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury on the infraorbital branch of the trigeminal nerve, ION-CCI)大鼠模型的病理学特征相类似。综合上述的研究背景,本实验制备了三叉神经痛大鼠模型并检测了各组三叉神经痛大鼠模型Vc组织中CBl受体的表达变化。2、目的我们假设TN大鼠模型的Vc组织中的神经元内存在CBl受体,因为目前仍无TN大鼠模型中CBl受体如何发挥相关作用方而的论述,此外,延髓下段的Vc组织中的神经元接受三叉神经的感觉神经传导的相关信息,所以,我们将TN的实验研究模型定为ION-CCI的大鼠模型,检验ION-CCI后大鼠Vc组织中CBl受体的表达变化,目的是为研究CBl受体与TN的临床治疗及致病机理的关联性打下实验基础。3、材料与方法3.1实验动物分组同一批次健康成体雄性SD大鼠,体重为300-350g,36只随机分为6组,每组6只。分为正常组、假手术组、ION-CCI1d组、ION-CCI3d组、ION-CCI7d组、ION-CCI14d组。雄性SD大鼠由南方医科大学珠江医院动物实验室以常规固体饲料饲养,温度控制在25℃左右,湿度在45%-50%之间,12h明暗循环(07：00—19：00)。为了消除因为动物行为的随意性对实验过程和结果的干扰,减少由此引起的假阳性结果,在实验开始之前每口08：00开始,用一自制塑料棒敲击笼壁四周和笼顶、触摸、提拿大鼠,于大鼠习惯之后,待大鼠平静时,用一自制毛刷刺激大鼠须垫部,3次/每侧,每次刺激需连续2次,两次刺激间隔不应少于30秒。两侧交替进行,直致大鼠从开始的抽鼻、探究、恐惧,甚至快速后退逃避、抓咬攻击等转为平静。3.2暴露并行眶下神经结扎术实验动物腹腔内注射10%水合氯醛(350mg/kg),将麻醉效果满意的大鼠仰卧并固定其头部和四肢,沿着其右侧第一磨牙龈颊侧边缘,向其口鼻方向纵向切开长约1cm的切口,分离暴露ION及周围约5mm神经组织,在肉眼或显微镜下使用两根之间距离大约为2mmm的5.0铬制肠线疏松环扎ION,结扎ION的紧张度要求是减小ION的直径,使ION传导延缓,不可以完全阻滞神经表层血管的血液传导,血液循环必须通畅。术后6.0缝合线缝合伤口。假手术组大鼠除不结扎ION外,其他方面与手术组大鼠完全相同。所有操作均需在无菌环境下进行,手术前后无需使用任何抗生素。3.3测得各实验组大鼠对电子VON FERY测痛仪所产生机械刺激的反应阈值。3.4制备ION组织标本和Vc组织标本。分别称取各实验组大鼠的体重,按体重腹腔注10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后,取结扎区ION进行组织病理学观察(weil氏和HE染色)。Vc组织的定位按照Paxinos等制定的大鼠脑立体定位图谱进行定位,切取定好位后的Vc组织,将标记好后的各实验组大鼠的Vc组织放入冰箱保存(-80℃)。3.5提取Vc组织抗原蛋白取出上述标记好的各实验组大鼠的Vc组织块用PBS液冲洗,将Vc组织放置于冰上用干净的剪刀尽量剪碎,再将其放入匀浆器内,每5mg加入300μl配制好的细胞裂解缓冲液后,裂解30min后,用移液枪移至1.5ml空离心管里,随后离心5min(12000rpm、低于4℃),将上清液取出之后小心放入已经准备好的空离心管里,然后置入冰箱冷冻储存(-20℃)。3.6测定Vc组织上清液蛋白含量3.7CBl受体的Western blotting检测4、统计方法与统计软件采用SPSS13.0统计软件对本实验的数据进行统计学分析,使用均数±标准差(x±s)来表达实验研究结果,单因素方差分析(One-Way ANOVA)和重复测量方差分析(Repeated Measures)用于多组间比较,首先进行方差齐性检验,如方差不齐,多重比较采用Dunnett’s进行检验；如方差齐性,多重比较使用Bonferroni进行检验；P<0.05表示差异有统计学意义。两组间比较用配对样本t检验分析(Paired-Samples T Test),P<0.05表示差异有统计学意义。5、结果(1)行为学观察结果显示,正常组和假于术组每天疼痛阈值比较并无显著差异,P均大于0.05。手术组和对照组比较术后疼痛阈值具有显著差异,P均小于0.05。(2)组织学观察结果显示：正常结构消失,术后缩窄环区域神经纤维肿胀逐渐明显；受压迫神经纤维粗细不一致、分布不均匀、甚至发生变性,被环扎的神经轴突裸露、稀疏、变细、厚薄不一、髓鞘正常结构消失,呈现出虫蚀状节段性脱失和空泡样改变,连续性中断,大量出现许旺细胞。(3)CBl受体在手术组(ION-CCI1d组、ION-CCI3d组、ION-CCI7d组和ION-CCI14d组)大鼠Vc组织中的含量表达依次上调,但正常组和假手术组大鼠Vc组织中CBl受体含量表达无显著性差异；假手术组大鼠手术侧与对侧Vc组织中CBl受体含量表达无差异：ION-CCl14d组手术侧与对侧Vc组织中CBl受体含量表达有显著差异。6、结论(1)外周神经损伤可呈时间依赖的形式导致Vc组织中CBl受体表达上调。(2) ION-CCI后诱导了其同侧和对侧CBl受体表达增加,在CCI侧CBl受体表达上调的程度显著大于其对侧。(3)CBl受体表达变化与周围神经疼痛阈值变化无直接关联。