论文部分内容阅读
目的：乙型肝炎病毒复发感染是影响肝移植受者的长期生存的重要因素之一。大剂量运用乙肝免疫球蛋白（HBIG）是预防HBV复发较有效的方法，但是其实际临床应用受到多种因素限制。全人源化基因工程抗体片段：anti-HBs-Fab由乙肝表面抗体（HBsAb）重链Fd段和完整的轻链组成，是完整抗体的1/3，仅有一个抗原结合位点。它属于小分子抗体，具有许多血源性抗体无法比拟的优点。本研究拟构建、生产和纯化携带全人源化anti-HBs-Fab基因的1型重组腺相关病毒rAAV1-HBs-Fab；建立该基因工程小分子抗体的体内外真核表达体系并检测其体外预防HBV感染的功能。方法：以一株来源于人源性噬菌体抗体库的HBsAg高亲和力Fab抗体基因的噬粒p3HB为模板，分别扩增出重链Fd和κ链基因；采用重叠PCR的方法分别在κ轻链和Fd重链基因的5’端接上人工合成的人κ链的前导编码序列，构建于真核表达载体plRES中IRES基因前后的两个多克隆位点。双酶切pIRES-Fab获得Fd-IRES-κ片段，克隆入腺相关病毒穿梭质粒pXXUF1中，命名为pXXUF1-HBs-Fab，酶切、PCR及测序鉴定。磷酸钙沉淀法转染PXX6，PXX12和pXXUF1-HBs-Fab三种质粒进入293细胞，包装具有感染力的1型重组腺相关病毒载体rAAV1-HBs-Fab。经过48小时培养后ELISA鉴定上清中anti-HBs-Fab的表达；收集293细胞反复冻融3次后，CsCl2密度梯度离心收集纯化病毒。Dot-Blot测定病毒滴度。pXXUF1-HBs-Fab分别通过脂质体介导法转染HEK 293细胞及尾静脉液压法转染C57BL/6小鼠。RT-PCR、ELISA、Western Blot和免疫组化等方法从基因和蛋白水平分析基因工程小分子抗体anti-HBs-Fab在体内外真核细胞中的表达。应用羊抗人Fab抗体通过免疫亲和层析法纯化转染细胞上清的anti-HBs-Fab，SDS-PAGE鉴定后用于以下功能检测：与HBsAg混合孵育后加入HepG2细胞培养液中，间接免疫荧光技术检测细胞表面黏附HBsAg的情况；加入Hep3B细胞培养液，检测其在抗人Fab抗体辅助作用下介导补体对细胞的杀伤功能，计算细胞死亡率；与人HBV感染血清混合后加入人原代肝细胞培养液中，PCR、ELISA及免疫组化等技术检测HBV感染人原代肝细胞的情况。结果：测序分析表明pXXUF1-HBs-Fab中人κ链的前导肽、IRES、Vκ及VH的序列正确，经酶切及PCR鉴定证实Fd-IRES-κ基因片段正确插入pXXUF1。包装293细胞培养上清检测到anti-HBs-Fab的表达。1型重组腺相关病毒rAAV1-HBs-Fab纯化后，病毒滴度达到1×1011pfu/ml。pXXUF1-HBs-Fab转染293细胞，获得稳定表达anti-HBs-Fab的细胞系293-anti-HBs-Fab。RT-PCR检测显示建系细胞胞内有Fd重链及κ轻链的mRNA；ELISA及Western Blot分析培养上清，证实基因工程小分子抗体anti-HBs-Fab的分泌性表达，最高表达量可达1396pg/ml并具有与HBsAg特异性结合的活性；免疫组化检测证实该细胞系胞浆中有棕黄色阳性颗粒。pXXUF1-HBs-Fab体内转染模型ELISA结果显示小鼠血清中含有513.6±10.5pg/ml的ami-HBs-Fab表达；免疫组化显示实验组小鼠肝脏细胞有棕黄色阳性颗粒，部分肾小球毛细血管腔内壁和肾脏集合管壁可见附着的Fab蛋白，其他肾实质细胞未见表达。从293-anti-HBs-Fab细胞系培养上清中纯化了5.65mg/L的anti-HBs-Fab，免疫荧光和流式细胞检测显示该基因工程小分子抗体处理后的HBsAg，不能黏附于HepG2细胞表面；处理后的Hep3B细胞在抗人Fab抗体辅助下大量被补体杀伤，细胞死亡率达87.98％；PCR检测显示处理后的人原代肝细胞中无HBV cccDNA合成，且ELISA及免疫组化结果表明肝细胞内及培养上清中均无HBsAg合成表达。结论：成功构建携带全人源化anti-HBs-Fab基因的1型重组腺相关病毒rAAV1-HBs-Fab；基因工程小分子抗体anti-HBs-Fab可在体内外转染pXXUF1-HBs-Fab的真核细胞中分泌性表达，并能通过肾小球滤过代谢；anti-HBs-Fab在体外具有预防HBV感染肝细胞的能力。为进一步研究rAAV1-HBs-Fab在预防肝移植后乙肝复发中的作用奠定了基础。