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多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, P.multocida)属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属,是革兰氏阴性菌,能够引起动物的急性和慢性感染,发病率和死亡率很高,临床特征表现为肺炎、萎缩性鼻炎、皮肤坏死、蜂窝组织炎、脓肿、脑膜炎和出血性败血症,引起的主要动物疾病包括禽霍乱、牛出血性败血症、兔出血性败血症、猪萎缩性鼻炎和猪肺疫。Lon是一种ATP依赖的蛋白酶,可降解异常蛋白和特异性调控其它调控蛋白,与细菌的致病性有关。从感染多杀性巴氏杆菌兔肝脏组织筛选鉴定lon基因,验证其酶活性,构建其突变株,对揭示多杀性巴氏杆菌的致病机制及调节机制有重要意义。本研究利用PCR扩增多杀性巴氏杆菌C51-17株lon基因,将其克隆到质粒pET30a(+)中, pET30a-Lon转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经0.1mmoI/L IPTG诱导表达,采用Ni-NTA His-Bind Resin纯化Lon蛋白。SDS-PAGE结果表明,重组Lon蛋白分子量大小97ku,主要以可溶性蛋白形式表达；western blot检测结果表明,重组蛋白能够被P.multocida阳性血清识别。纯化的重组蛋白Lon具有ATPase活性,其ATPase的酶活性可达到27708.47μmol/mg-min。扩增C51-17株lon基因的上、下游同源臂,将其克隆至质粒pBC-SK相应的酶切位点,构建自杀性质粒pBC-lon;将卡那霉素抗性基因表达盒克隆至lon的上、下游同源臂之间,构建重组转移质粒pBC-Δlon。将pBC-Δlon电转化至C51-17感受态细胞中,在抗性培养基上进行筛选、PCR和测序进一步验证,构建了多杀性巴氏杆菌Δlon突变菌。连续传20代,多杀性巴氏杆菌Δlon突变株具有良好的遗传稳定性；生化实验结果表明,Δlon突变菌与亲本菌的生化特性一致。Δlon突变菌和亲本菌对RK13细胞的粘附分别为9.10±0.75×104CFU/孔和9.7±0.69×103CFU/孔。体外生长曲线表明,在37℃培养时,Δlon突变菌生长速度基本和亲本菌株一致,在42℃培养时,Δlon突变菌和亲本菌的生长速度比在37℃慢,生长能力相近。抗逆性试验表明,Δlon突变菌和亲本株在紫外辐射和50℃条件下,耐受能力基本一致；在H2O2条件下,几乎没有耐受能力。小鼠的致病性试验结果表明,Δlon突变株的LDs0为63.1CFU,而亲本菌C51-17的的LD5o为26.24CFU。本研究表达了多杀性巴氏杆菌Lon蛋白,验证具有ATPase活性,利用正向筛选同源重组技术构建了多杀性巴氏杆菌Δlon突变株,具有良好的遗传稳定性和生长特性,对RK13细胞有粘附能力,对小鼠有一定致病性,为进一步研究Lon蛋白在多杀性巴氏杆菌中的致病机制以及验证Lon蛋白调节机制奠定基础。