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研究背景乳腺癌是目前严重危害全球女性健康与生命的恶性肿瘤之一,且其发病率正呈现逐年上升的态势。2014年的一项调查显示,在美国,约有232670女性被诊断为浸润性乳腺癌,其致死人数可能高达40000人。中国女性的乳腺癌发病率虽然相对较低,但在北京、上海、天津等经济较发达地区乳腺癌仍然是危害妇女健康但重要恶性肿瘤,且发病率逐年升高。诸多研究表明,乳腺组织内较高水平的雌激素表达在乳腺癌的发生发展中起重要作用,临床上也常将雌激素受体作为乳腺癌内分泌治疗的重要靶点。由ESR1基因编码的雌激素受体ER,属于核受体超家族,具有其家族典型的分子和功能结构,主要是一种核蛋白---配体依赖性转录因子。ER-配体复合物直接与特定的DNA序列即雌激素反应元件(ERE)结合,同时与共促进蛋白或共阻遏蛋白相互作用来调节的雌激素相关基因的转录,调节包括肿瘤发生和进展在内的各种生理和病理过程,其作用机制目前尚不完全清楚。因而关于雌激素在乳腺癌发生,发展中的作用及机制的研究非常重要。BMP-Smadl通路与胚胎发育和组织的稳态相关,这一通路对DNA的损伤应答以及肿瘤的发生发展有重要的影响。当发生基因毒性刺激时,由BMP激活的Smadl的丝氨酸239位点在细胞核内被共济失调毛细血管扩张突变基因(Ataxia telangiectasia-mutated gene ATM)磷酸化,破坏了Smad1和蛋白磷酸酶PPM1A的相互作用,使得Smad1的激活和上调被增强。进而,Smad1通过Mdm2介导的和p53相互作用来抑制癌基p53泛素化和降解。最终,细胞的增殖与生存得到调节。由此可见,深入研究BMP-Smad1通路在肿瘤中的作用,尤其在乳腺癌细胞周期和凋亡中的作用将具有重要的生物学意义。研究目的1)研究雌激素促进乳腺癌细胞的发生和发展是否依赖于BMP-Smad1通路,探究雌激素在乳腺癌作用过程中参与协同的其他重要通路。2)阐明BMP-Smad1通路参与调节雌激素在乳腺癌细胞以及原代细胞中作用的分子机制,探究该通路下游作用的基因靶点。3)评估Smad1及其通路下游作用基因靶点作为雌激素促进乳腺癌诊断和预后标志物的可行性,并探讨其作为乳腺癌治疗靶点的可行性.研究方法1)在乳腺癌MCF-7细胞系以及MDA-MB-231细胞系和原代小鼠胚胎成纤维细胞MEFs中加入不同浓度的雌激素,作用不同时间后提取RNA和蛋白质,应用实时定量PCR(real-time PCR)、蛋白质印记(Western Blot)法明确雌激素可以激活BMP-Smad1通路。2)在乳腺癌MCF-7细胞系以及MDA-MB-231细胞系中行细胞功能研究及裸鼠成瘤试验,明确雌激素促进乳腺癌细胞增殖是通过BMP-Smad1通路。(a)在Smad1敲除的乳腺癌MCF-7细胞系以及MDA-MB-231细胞系中加入雌激素后,进行WST-1细胞增殖试验。(b)利用 Annexin V-FITC/PI 试剂盒将细胞株 MCF-7-ShSmad1/ShCTRL、MDA-MB-231-ShSmad1/ShCTRL在流式细胞仪上检测细胞周期。(c)将细胞株 MDA-MB-231-ShSmad1/ShCTRL、MCF-7-ShSmad1/ShCTRL 进行裸鼠成瘤实验,观察裸鼠成瘤体积。3)选用MDA-MB-231-Sh Smad1和MDA-MB-231-CTRL细胞株,分别加入雌激素作用后进行CHIP实验。4)在MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞系中分别敲除p38及Smad1,观察在雌激素存在的情况下其下游转录因子的激活及细胞周期的变化和细胞增殖。研究在雌激素作用后其下游转录因子和Smad1蛋白之间的相互作用。5)收集和分析临床肿瘤样本和正常样本,进行雌激素受体Estrogen receptor,p-Smad1,Smad1染色,进行相关性分析。研究结果1.雌激素激活BMP/Smad1通路。我们发现雌激素能激活小鼠胚胎成纤维细胞、乳腺癌MCF-7细胞系以及MDA-MB-231细胞系中的BMP-Smad1通路。Smad1作为BMP-Smad1中的关键基因,能够在雌激素刺激下提高其转录和翻译效应。雌激素作用4小时后p-Smad1被激活,并在12小时达到最大值。当Smad1被敲除后,雌激素不能影响的Smad1表达。2.BMP/Smad1通路在乳腺癌组织中被激活,并与雌激素受体表达正相关。我们发现,Smad1表达上调与p-Smad1的活化被抑制,且Smadl水平与ERα呈正相关关系。3.雌激素促乳腺癌细胞增殖迁移作用部分依赖于Smadl。在乳腺癌细胞系中,Smad1表达增强,促进细胞增殖和迁移。在Smad1敲除的乳腺癌细胞中,雌激素对细胞增殖和迁移的影响会被削弱。在裸鼠体内肿瘤实验中,敲除了Smad1的肿瘤体积小于对照组。4.p38MAPK-c-Myc通路操控雌激素在乳腺癌细胞中的促增殖作用。通过精心筛选,我们发现p38蛋白下游c-myc蛋白水平的显著增强。在雌激素作用下,当Smad1被敲除后,c-Myc的表达被部分抑制。CHIP实验发现Smad1会与c-Myc的启动子结合,其结合作用会在雌激素作用下进一步增强。5.雌激素通过Smad1和p38 MAPK通路上调c-Myc表达,从而发挥促细胞增殖作用,调节细胞周期。当Smad1被敲除后,雌激素对于c-Myc过表达细胞的促增殖减弱,然后逐渐恢复。进一步的细胞周期实验表明G1调控点可被转换。研究结论雌激素通过Smad1和p38 MAPK通路调节其下游靶基因c-Myc的表达,进而促进细胞增殖。