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鉴于LH-β是动物生殖和发育调节中十分关键的性激素，国内外对猪LH-β基因的研究甚少，尚未见到对其在体内外转基因表达及其对动物免疫和生殖系统的深入研究，因此，我们就梅山猪LH-β基因的克隆及其原核、真核表达和体内转基因表达对小鼠生殖和免疫系统作用和机理进行了较系统的研究，为研制畜用新型高效生殖调节基因制剂奠定坚实基础。 首先，我们率先克隆了优良高产地方猪种梅山猪LH-β基因。从梅山猪脑垂体样品提取RNA后，用RT-PCR的方法克隆获得了梅山猪LH-β基因，与其他地方来源于猪LH-β有98％同源，其开放阅读框长度为417bp，编码139个氨基酸残基，分子量为14.7kD，等电点为7.80，疏水氨基酸占55.4％，亲水氨基酸占31.7％，碱性氨基酸占7.9％，酸性氨基酸占5.0％。基因的1-31位核苷酸编码10个氨基酸残基的信号肽，31-448位核苷酸编码139个氨基酸残基的成熟片段。 第二，用DNA重组技术将已克隆的猪LH-β cDNA片断插入pGEX-1λT质粒，构建了猪LH-β基因的原核表达质粒pGPLH-β，转化大肠杆菌，以质粒PCR和BamHI、EcoRI双酶切筛选鉴定转化子，获得了含420bp插入克隆基因正确的重组子。以IPTG诱导融合蛋白表达，经RT-PCR检测发现420bp的特异性LH-β条带；通过SDS-PAGE分析，在43KD处出现GST-PLH-β融合蛋白条带，其表达量占总细菌蛋白量的23％，证明吕学斌:梅山猪LH一p基因的克隆及表达效应研究猪LH一日基因得到了正确转录和表达。提取纯化回收融合重组蛋白，并以重组蛋白免疫家兔，制备了特异性抗体滴度为25600抗猪LH一p的高免兔血清。 第三，首次将克隆到的猪LH一p基因亚克隆到真核表达型载体VRIO20上，通过质粒PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用BamHI、Bglll双酶切鉴定重组子。得到的重组真核表达质粒转染Cos7细胞株，RT一PCR检测猪LH一p。结果显示:通过质粒PCR和双酶切分析，得到猪LH一p基因以正确方向插入的重组真核表达质粒VPLH一p。重组质粒VPLH一p经脂质体介导转染Cos7细胞，培养不同时间后提取mRNA进行RT一PCR，发现转染细胞RNA中含有与LH一p基因对应的mRNA:这些结果表明己成功构建了PLH一p的真核表达质粒，能正确转录表达LH一p。 第四，为了探讨vPLH一p体内转基因表达对小鼠生殖和免疫系统的调节作用和机理，，我们首次制备阳离子脂质体包装VPLH一p质粒，与PMSG和hCG以及重组LH一旦蛋白分别肌肉注射小鼠，系统地研究了它们对小鼠的生殖和免疫机能的影响。实验结果发现:各实验组小鼠外周血液的免疫细胞数量均较对照组增多，在14天时差异显著(P<0 .05);血清IgG含量亦较对照小鼠明显增加，其中眺D、E、F组较突出。各实验组血清中LH和FSH的水平均比对照组升高，实验组之间差异不明显 (P>0.05)。实验组白鼠每窝产仔数及成活率均高于对照组，平均多1.4只，但各实验组间差异不显著〔p>0.05)。这些结果初步表明:本实验克隆构建的猪VPLH一p质粒、重组LH一p蛋白均能发挥明显的生殖生理调节作用，可较好地促进雌性动物的排卵、怀孕和正常产仔;并且对动物的免疫机能无不良影响，还表现出一定的免疫增强效应。阳离子脂质体分子包装VPLll一p质粒体内转染表达安全无毒副作用。本实验为进一步深入研究新型动物生殖生育调节墓因制剂、开辟高效安全、经济简便的促进动物繁殖的新途径奠定了良好的纂础。