目前公认的对缺血/再灌注损伤最强、最有效的内源性保护机制是缺血预适应。但在临床中，由于发生心肌缺血的时间无法预计，所以在缺血前进行预处理，在实际应用上受到限制。2003年，Zhao等在狗的缺血—再灌注实验研究中发现了一个新的心肌保护现象，称之为缺血后适应，即于再灌注前给予数次短暂的再灌注—再缺血处理，其对再灌注损伤心肌的保护效应不亚于心肌缺血预适应。值得注意的是，Zhao等最初进行后适应现象的研究时处理的时间周期较长(5min再灌注-5min再阻断，3个周期，总时程30min)，最后以阴性结果告终。后来他们把时间周期缩短(30s再灌注-30s再阻断，3个周期，总时程3min)，结果产生了显著的心肌保护效应。这一研究过程提示，有效进行缺血后适应操作的时间窗位于再灌注的极早期(狗为再灌注开始的3min)，此后，在兔心也观察到同样的缺血后适应现象。但是在大鼠心脏，当时还未见相关报道。为此，我们首先研究了大鼠心脏是否存在缺血后适应，以及有效进行缺血后适应操作的时间窗。研究结果表明大鼠心脏存在缺血后适应，进行缺血后适应操作的最佳时间窗在再灌注开始1min。 在大鼠心脏的缺血后适应现象和缺血后适应发生的时间窗得到确定后，我们试图探讨在这一时间窗内给予药物干预，是否也能产生同样的心肌保护效应。如果获得阳性结果，将对临床治疗具有潜在的临床应用价值。我们从心肌再灌注损伤的发病机制入手，选择能对抗这一病理过程触发因素的药物进行干预。根据目前的研究，再灌注后迅速生成的活性氧类物质和细胞内Ca2+超载是启动心肌缺血/再灌注损伤这一病理过程的两个最重要的触发因素。为此，本研究选用抗氧化剂-还原型谷胱甘肽和Na+/Ca2+交换抑制剂-KB-R7943，对在体大鼠心肌缺血/再灌注模型于再灌注极早期进行药物干预，观察它们对损伤心肌的保护效果，并与缺血后适应的效果相比较；利用离子荧光测定技术，观测谷胱甘肽和KB-R7943对模拟缺血/再灌注时单个心肌细胞胞内游离Ca2+和ROS含量的影响，分析两者间的相互关系；利用细胞凋亡指数和Caspase-3活性的检测，观测谷胱甘肽和KB-R7943的心肌保护效应，与其可能存在的抗凋亡作用之间的关系。 本研究分四部分： 一、不同模式缺血后适应对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用 目的：探讨大鼠心脏是否存在缺血后适应，以及产生最佳心肌保护效应的时间窗。 材料与方法：实验用240-260g健康Wistar大鼠，按照文献方法建立心脏局部缺血/再灌注模型，可逆性阻断左冠状动脉前降支血流后，心电图显示ST段抬高≥0.15mv时为模型缺血成功。实验结束时用Evensblue和TTC双染，利用图像分析仪测定心肌危险区与梗塞区面积；同时留取血浆标本，检测CK和MDA含量；并对再灌注3h时后LVSP-LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的恢复率进行对比分析。 结果： 1.不同模式缺血后适应对心肌梗塞面积的影响： 实验分为6组进行。 (1)假手术组：仅在LAD下穿线，不结扎，总时程210min (2)缺血/再灌注组：缺血30min，再灌注3h (3)10s缺血后适应组：缺血30min，于再灌注前进行后适应干预(10s再灌注-10s再阻断，3个周期，总时程1min)，后再灌注3h (4)30s缺血后适应组：缺血30min，于再灌注前进行后适应干预(30s再灌注-30s再阻断，3个周期，总时程3min)，后再灌注3h (5)1min缺血后适应组：缺血30min，于再灌注前进行后适应干预(1min再灌注-1min再阻断，3个周期，总时程6min)，后再灌注3h (6)3min缺血后适应组：缺血30min，于再灌注前进行后适应干预(3min再灌注-3min再阻断，3个周期，总时程18min)，后再灌注3h 1.1危险区面积占左心室面积的百分比：这一比值在各组之间无显著性差异，表明各组动物模型的缺血程度大体一致，因而具有可比性。 12心肌梗塞面积占危险区面积的百分比(AN/AAR比值)：这一比值在10秒后适应组及30秒后适应组分别为(30.95±4.26)％和(32.46±5.26)％，与缺血/再灌注组(48.85±5.19)％相比均明显降低(P＜0.05)，但10秒后适应组降低更明显；而1分钟后适应组和3分钟后适应组与缺血/再灌注组相比无明显差异。这表明①大鼠心脏存在缺血后适应产生的心肌保护作用；②对大鼠心脏进行缺血后适应操作的时间窗在再灌注极早期，即再灌注开始后的1min-3min，其中再灌注1min是最关键的时期。 2.对血浆肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)含量的影响： 各组CK与MDA含量的减少与心肌梗塞面积的减小基本平行。与缺血/再灌注组(73.23±3.02U/ml；20.54±2.66nmol/ml)相比，CK及MDA含量在10秒后适应组(45.85±4.78U/ml；12.85±0.93nmol/ml)及30秒后适应组(46.76±2.11U/ml；13.09±1.26nmol/ml)均显著减小(P＜0.05)，而1分钟组与3分钟组无明显变化。 3.对各组血流动力学指标的影响： 缺血前各组间的LVSP-LVDP,HR，+dp/dtmax,-dp/dtmax值无显著差别(P＞0.05)；在再灌注3h时，单纯缺血/再灌注组上述各指标均显著下降(P＜0.05)；不同模式的缺血后适应的各组，上述指标均显著回升，但组间无统计学差异。 二、再灌注极早期应用GSH和KB-R7943药物干预对缺血/再灌注大鼠心肌的保护作用 目的：应用抗氧化剂(还原型谷胱甘肽，GSH)和Na+/Ca2+交换抑制剂(KB-R7943)在再灌注极早期进行干预，观察它们对大鼠心肌局部缺血/再灌注损伤的保护作用。 材料与方法：选用健康Wistar大鼠，体重240-260g。缺血/再灌注模型的建立同第一部分。为使药物于再灌注开始后1min内在冠脉循环中保持较高的有效浓度，我们建立了经左心室-主动脉-冠状动脉(LAC)途径给药，即将药物溶液1ml经左室测压管的侧孔匀速注入，药液随血流从左室经主动脉进入冠脉。常规静脉给药则从右侧股静脉注入。标本的留取及检测同第一部分。 三、GSH和KB-R7943药物干预对模拟缺血/再灌注心肌细胞游离钙及自由基的影响 目的：进一步探讨GSH和KB-R7943对心肌产生的保护作用与它们抑制ROS生成及/或抑制Ca2+超载的关系，并分析ROS生成与Ca2+超载在这一病理过程中的相互关系。 材料与方法：实验用体重240-280g健康Wistar大鼠，利用酶法急性分离其单个心室肌细胞。将细胞负载fura-2/AM或DCFH-DA荧光染料，在CCD离子成像系统中直接测定心肌细胞游离Ca2+及ROS的变化。用模拟缺血台氏液(氧分压(43.2-59.1)mmHg、pH6.6和无糖)和正常台氏液对细胞进行模拟缺血/再灌注。 四、再灌注极早期应用GSH和KB-R7943药物干预对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡和超微结构的影响 目的：观察GSH和KB-R7943对缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡和超微结构的影响。