随着世界范围内溴代阻燃剂的广泛禁用,有机磷酸酯类阻燃剂的使用量大幅增加,这些阻燃剂作为添加剂加入到人类生产生活各种产品中,经过渗透、磨损逐渐渗入到周围环境中,对人类和野生动物产生危害。科学家们对有机磷酸酯类阻燃剂进行调查研究,在水、土壤、鱼类、鸟类体内检测到了各种浓度范围的有机磷酸酯类阻燃剂,且发现其具有内分泌和甲状腺毒性,但对其神经毒性及其机制的研究尚少。本课题选取磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tris(2,3-dichloropropyl)phosphate,TDCPP)和三(2-羧乙基)磷(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)两种典型有机磷酸酯类阻燃剂为研究材料,以PC12神经元细胞为模型,开展了TDCPP和TCEP的神经毒性研究,并初步探索其可能的神经毒性作用生物分子机制。以NGF刺激分化的PC12细胞为体外培养神经细胞模型,选用暴露浓度为0-75μM的TDCPP和0-400μM的TCEP,分别对PC12细胞进行0-6天的染毒处理。采用倒置显微镜对细胞形态进行观察,利用MTT法对细胞生存率进行测定,运用流式细胞仪对细胞凋亡和细胞内Ca2+改变进行荧光检测;采用Western-Blotting(WB)技术对PC12细胞神经生长相关的关键蛋白(如Ca MK2、GAP43、tubulin、NF-H),以及MAPK信号通路蛋白及其磷酸化水平进行检测和分析。并采用Ca MK2蛋白抑制剂KN93抑制Ca MK2活化后检测MAPK通路磷酸化水平的改变,以期进一步揭示MAPK通路与Ca MK2蛋白磷酸化之间的关系。研究分为三个部分,培养细胞分组及主要研究结果如下:一、TDCPP/TCEP染毒PC12细胞导致其神经毒性检测TDCPP暴露下PC12细胞生存率剂量效应的细胞分组为:正常对照组、TDCPP染毒1μM、5μM、15μM、20μM、25μM、50μM、75μM组共8组,染毒6天;检测TCEP暴露下PC12细胞生存率剂量效应的细胞分组为:正常对照组、TCEP染毒15μM、20μM、40μM、80μM、150μM、200μM、400μM组共8组,染毒6天;为检测染毒后生存率时间效应,染毒浓度为50μM TDCPP,细胞分别持续染毒0-6天,各持续染毒时间段均设有正常对照组,且每组设6复孔。实验中对各组细胞实时观察并拍照记录。检测TDCPP染毒后细胞凋亡率的实验细胞分组为0μM、5μM、15μM、25μM、50μM TDCPP染毒组,染毒时间为持续染毒3天和持续染毒6天,每组设3复孔。显微镜观察结果显示在TDCPP或TCEP染毒作用下,PC12神经细胞的形态均发生改变,神经突触长度变短数量减少,神经细胞间的神经丝连接减少、形成的神经结节也减少,神经细胞变圆变小,生存数量减少;不同染毒浓度的TDCPP/TCEP暴露下,PC12细胞生存率均减少,存在剂量效应关系;不同染毒持续时间的TDCPP暴露下,PC12细胞生存率亦减少,存在时间效应关系;不同浓度和不同染毒时间TDCPP暴露下,PC12细胞凋亡率呈现增多的趋势,且同样存在时间和剂量效应。这些结果均提示了TDCPP/TCEP对PC12细胞具有神经毒性,且表现在发育毒性和细胞毒性两个方面。二、TDCPP/TCEP导致PC12细胞神经毒性的生物标志物实验用PC12细胞以1×105细胞密度接种至6孔培养板中,隔天对细胞进行换液,培养液含终浓度为20μg/L的NGF以刺激分化PC12细胞。培养至细胞铺率达70%后对细胞进行染毒换液。细胞分组为正常对照组、溶剂对照组、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM组;或正常对照组、溶剂对照组、TCEP 40μM、80μM、150μM、200μM组,每组3个复孔,2-3天换一次液,持续染毒6天。分别对各组PC12细胞进行收集,提取蛋白后采用WB技术检测目标蛋白。结果显示OPFRs影响PC12细胞内调节蛋白Ca MK2、GAP43的翻译水平,TDCPP使其表达量相比正常细胞降低约20%-40%,且与TDCPP染毒存在剂量效应关系;TCEP使GAP43表达量相比正常细胞降低约50%,而CAMK2的表达水平呈现增长的趋势。另外,PC12细胞内骨架蛋白tubulin、NF-H的翻译水平在TDCPP作用下最大降幅约为30%,且同样与TDCPP染毒存在剂量效应关系;而TCEP作用下骨架蛋白tubulin翻译水平同样降低约20%-30%,NF-H翻译水平却呈现增多的趋势,最多相比正常组增加约1倍。所以,在OPFRs作用下神经生长相关蛋白翻译水平的改变,可引起神经细胞生长发育受损,损伤神经细胞PC12的正常形态,阻碍其发挥正常功能,从而引起PC12细胞神经毒性,而以上几类与神经相关目标蛋白,可能成为其神经毒性效应主要的生物标志物。三、TDCPP导致PC12细胞神经毒性的可能分子生物机制流式细胞仪检测细胞内Ca2+浓度水平的改变细胞分组为正常对照组、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM组,每组3个复孔,2-3天换一次液,分别持续染毒1-6天;WB检测Ca MK2、MAPK通路蛋白及其磷酸化水平的改变细胞分组为:①持续染毒4天,组别为正常对照组、TDCPP 5μM、15μM、25μM、50μM组,以探究其蛋白磷酸化水平改变与TDCPP染毒的剂量效应关系;②以50μM TDCPP染毒,分别持续染毒1-6天,以探究其蛋白磷酸化水平改变与TDCPP染毒的时间效应关系。为确定Ca MK2与MAPK通路之间关系实验细胞分组为正常对照组、正常对照+KN93处理组、25μM TDCPP染毒组、25μM TDCPP+KN93处理组、50μM TDCPP染毒组、50μM TDCPP+KN93处理组。KN93抑制剂使用浓度为10μM,前处理时间为1小时,实验细胞连续染毒时间为6天。实验结果显示在TDCPP的作用下,PC12细胞内Ca2+稳态受到破坏,随着染毒剂量增加呈现细胞内Ca2+浓度水平增多的剂量效应关系,且随着染毒时间的延长细胞内Ca2+浓度水平同样呈现增多的趋势。Ca MK2和MAPK通路蛋白磷酸化水平增加,其中Ca MK2的磷酸化呈现明显的时间和剂量效应;JNK和p38蛋白磷酸化水平增多表现相似的变化趋势,存在明显的剂量效应;Erk1/2蛋白磷酸化水平增多则存在明显的时间效应。另外TDCPP染毒的PC12细胞中,MAPK通路磷酸化水平增多可以被Ca MK2磷酸化抑制剂部分抑制,提示了MAPK信号通路与Ca MK2蛋白之间存在相互作用关系,暴露于TDCPP下的PC12细胞内MAPK信号通路部分被直接激活,部分由Ca MK2的磷酸化引起。由此,第二信使Ca2+、关键蛋白Ca MK2和MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平的改变,可能成为典型有机磷酸酯类阻燃剂TDCPP暴露所致PC12细胞产生神经毒性效应的生物分子作用机制。综上,可得出如下结论:TDCPP/TCEP可引起PC12细胞神经毒性,调节蛋白Ca MK2、GAP43和骨架蛋白tubulin、NF-H可能成为其重要的生物标志物,而信号通路参与调节其神经毒性,细胞内Ca2+浓度水平增多、Ca MK2磷酸化、MAPK信号通路激活可能成为TDCPP引起PC12细胞神经毒性的生物分子机制。本课题实验研究结果将丰富以TDCPP/TCEP为典型有机磷酸酯类阻燃剂的神经毒性的基础理论知识,并为OPFRs所致神经毒性评价提供了基础数据支持。