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目的:结合目前最新文献研究进展,同时通过临床观察补肾活血汤对"肾虚血瘀"髌骨骨折术后的临床疗效,和细胞实验探索骨折愈合过程中MSCs迁移的分子机制,从而探讨补肾活血汤促进骨折愈合的机理,为中医药促进骨折修复与骨重建提供新思路和药理靶点,以此丰富"肾主骨生髓"和"活血祛瘀生新"等中医理论。方法:一、文献研究归纳、总结髌骨骨折的治疗进展,特别是对手术治疗内固定术的利弊点进行分析。联系中医药治疗方法干预骨折愈合的临床报道,分析骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)迁移与骨折愈合、补肾活血法关系,及其内在微环境(趋化因子、信号通路)的分子机理。二、临床研究随机数字表法对60例行克氏针张力带内固定的老年髌骨骨折术后的患者,分为治疗组和对照组。其中,治疗组33例为术后连续服用补肾活血汤2周,而对照组不服用中药,基本处理与治疗组一致。利用视觉模拟法(Visual Analog Scale,VAS)记录两组治疗前后的疼痛评分,定期复查X-ray确定两组骨折愈合时间,骨折愈合后采用Bostman评分法评估两组的膝关节功能。三、实验研究(一)、补肾活血汤提取物对大鼠BMSCs体外迁移及CCR2蛋白表达的影响索氏提取法分别提取补肾活血汤石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物。BMSCs采用全骨髓贴壁法培养,P3代细胞用于实验。补肾活血汤四种提取物按照10,50,100μg/mL对BMSCs进行Transwell实验,筛选迁移活性部位。免疫蛋白印迹法(Western blot)和细胞免疫荧光检测活性部位干预BMSCs表达CCR2蛋白量。(二)、补肾活血汤活性部位对大鼠BMSCs表达Wnt5a的影响Western blot检测补肾活血汤活性部位10,50,100μg/mL浓度组的Wnt5a蛋白表达,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)观察各组 Wnt5a mRNA 表达。(三)、Wnt5a基因沉默大鼠BMSCs及其迁移活性的研究RT-qPCR观察Wnt5a-RNAi慢病毒载体和阴性对照病毒转染BMSCs后的Wnt5a mmRNA表达情况,镜下观察各组绿色荧光表达量。Western blot检测各组Wnt5a蛋白表达及其Transwell实验观察各组迁移细胞数量。结果:一、文献研究髌骨骨折的内固定术有其利弊,但是均能达到全面恢复髌骨功能的作用,而结合补肾活血法辅助治疗,可以促进其骨折愈合。同时掌握骨折愈合过程中的分子机制规律,有利于找到促进骨折修复与骨重建的药理靶点。而补肾活血法的治疗靶点可能与募集BMSCs迁移至损伤部位相关,所涉及的趋化因子、信号通路的机制较多,而MCP-1/CCR2信号轴及其Wnt5a信号通路可能调控BMSCs迁移,着力研究这两条机制,能为补肾活血汤促进骨折愈合的研究带来新的前景。二、临床研究VAS评分:两组在治疗后的评分均较同组治疗前降低,差异有统计学意义(P<0.01)然而两组治疗后的疼痛评分结果没有差异,差值亦没有统计学意义(P>0.05);骨折愈合时间:治疗组的骨折愈合时间较对照组的缩短,差异有统计学意义(P<0.01);Bostman评分:治疗组为(28.21±1.19),对照组为(26.22±1.15),两组差异有统计学意义(P<0.01)。三、实验研究补肾活血汤石油醚部位、乙酸乙酯部位、乙醇部位和水提物均能促进大鼠BMSCs体外迁移,其中石油醚部位三浓度较空白组差异均有统计学意义,以100μg/mL为最佳(P<0.01);Western blot示补肾活血汤石油醚部位促进CCR2蛋白,与空白组比较有统计学差异,亦以100 μg/mL浓度最佳,与细胞免疫荧光结果一致;Western blot和RT-qPCR显示补肾活血汤石油醚部位能促进大鼠BMSCs表达Wnt5a;RT-qPCR结果示三段Wnt5a-RNAi慢病毒载体有效抑制Wnt5amRNA表达,镜下观察转染效率约为70%,而Western blot也表明了 Wnt5a-RNAi组较空白组和空载体组的Wnt5a蛋白表达有所下降,差异有统计学意义(P<0.001),而Transwell实验也显示了 Wnt5a-RNAi组细胞迁移数量下降。结论:一、补肾活血法与骨折愈合关系密切,分析其中BMSCs迁移的分子机制,特别是趋化因子和信号通路,对于探索骨折愈合的治疗靶点有重要的意义。二、补肾活血汤能缩短髌骨骨折术后的愈合时间,且改善术后膝关节功能。三、补肾活血汤促BMSCs体外迁移的活性部位为石油醚部位,其机制可能与刺激MCP-1/CCR2信号轴相关,及其上调Wnt5a表达有关,另外初步认为Wnt5a信号通路与BMSCs体外迁移有密切关系。