小桐子,大戟科植物,是重要的能源植物之一,具有耐旱、耐贫瘠等优良性状,兼具抗癌抗菌等多种用途。随着全球气候变化,干旱对农业的威胁日益严重。弄清小桐子抗旱机制,获得抗旱候选基因是应对气候变化,因应粮食安全战略的有效手段之一。本实验室前期工作发现,空气干旱后小桐子幼苗中脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、可溶性糖等渗透调节物质含量上升,从而使植物渗透势、水势降低,且叶片中上述渗透调节物质的含量均高于茎中。随后的研究工作表明,干旱锻炼提高小桐子幼苗的抗旱性,其生理生化机制是提高了前述渗透调节物质的含量,其中脯氨酸含量的提高是通过增加其合成代谢中各关键酶的活性,降低分解代谢中酶的酶活。在上述工作的基础上,本研究旨在探讨干旱锻炼之后小桐子快速适应干旱胁迫过程中,miRNA的作用机制。在实验室前期工作的基础上,选定15%PEG6000模拟干旱锻炼48 h,之后空气干旱72 h。在干旱锻炼0 h(CK)、6 h、12 h、24 h、48 h,及干旱胁迫在24 h、48 h、72 h取叶片,此外将正常生长48 h的材料,与处理材料同时进行空气干旱,72 h后取材作为另一对照(CK72)。以上处理重复3次,共得到27份材料。将这些材料提取RNA,以Illumina公司HiSeq2000平台,进行转录组和microRNA组高通量测序。分析测序样品相关关系图,发现干旱锻炼前12 h,植物整体的转录层面与CK00差别不大锻炼;24 h后植物基因转录发生较大变化;锻炼48 h,样品与干旱对照及处理样品一致性更高,说明此时植物已将转录方向调整得适应干旱。CK72与CK00差异很大,干旱处理样品与CK72较为一致,而锻炼样品与CK00更为一致。因此用CK00作为干旱锻炼样品的对照,CK72作为干旱胁迫对照的做法较为恰当。将测序所得Raw reads过滤去除dirty reads后microRNA组得到313141553条clean reads,转录组得到322270640条clean reads。microRNA组序列与小桐子基因组、miRBase数据库及Rfam等数据库比对后,将得到的miRNA候选序列结合基因组序列,以miReap、RNA Structure等工具软件主要根据最大自由能(maximum free energy)预测miRNA二级结构,分析完毕后得到2907个Known-miRNA,2673个Novel-miRNA。经差异表达分析,发现差异表达KmiRNA为分属22个基因家族的52条KmiRNA及15条差异表达NmiRNA。将转录组基因表达数据计算FPKM均一化后,空气干旱样品中基因的表达量与CK72的比较、干旱锻炼样品中基因的表达量与CK00的比较,得到变化倍数,以2为底对表达变化倍数取对数,记为FoldChange。以1.5为阈值,去除FoldChange绝对值较小的基因后,共得到485个非冗余差异表达基因。此外,将CK72和CK00作比较,二者间有667个基因差异表达,这些基因的表达变化是二者相差总计5天的生长和后3天空气干旱所致。将干旱锻炼和空气干旱处理所得的485个非冗余差异表达基因与两组CK的差异表达基因比较,去除对照中的差异表达基因,剩余285个差异表达基因,去除FPKM较小的基因后得到差异表达基因106个。通过对差异表达miRNA靶基因的生物信息学分析,整合GeneBank中的功能注释、Gene Ontology注释和KEGG注释,发现这些差异表达miRNA从4方面调整植物体状态:(1)调控基因转录和翻译。首先,以miRNA调控转录因子,可能一定程度上取代或补充激素,调控基因表达。其次,以miRNA调控相关酶类靶基因,调控其它基因表达。第三,miRNA调控相关酶类或细胞器组分靶基因的表达以调控其它蛋白的翻译。(2)通过miRNA-磷酸肌醇通路和Ser/Thr激酶传递干旱信号。(3)通过脂质代谢的调控改变细胞膜脂质成分。(4)活性氧调节。上述四方面的作用,通过一些共同靶基因形成相互作用,共同协调的miRNA-靶基因干旱响应调控网络。以miRNA的TPM(>15)和靶基因的FPKM(>15)进行数据归一化处理,分别计算miRNA和预测靶基因的表达表达变化倍数(FoldChange)。选择miRNA表达变化倍数FoldChange变化趋势与预测的靶基因FoldChange的相反的,初步确定本研究中差异表达miRNA的靶基因,发现了12对miRNA-靶基因。具体情况有待进一步验证。随后结合差异表达novel-miRNA数据和靶基因预测结果,针对pre-novel-miR56(pre-jcu-miR56)设计引物,将之导入酿酒酵母INV SC1。以野生型酿酒酵母INV SC1进行干旱、高温和高盐胁迫强度试验,确定各胁迫条件为高温胁迫45℃,高盐胁迫加入8%NaCl(1.37 mol/L)。将经过测序验证的jcu-miR56重组菌株和pYES2野生型INV SC1两个对照进行上述逆境处理,发现高温、高盐条件下导入pre-jcu-miR56的菌株生长情况均比其它菌株好。为分析这种差异的原因,本研究采用酵母鉴定微孔板观察重组酵母的碳源利用变化情况。jcu-miR56的导入,使酵母的可利用碳源增加了18种。其中,增加糖及其衍生物6种,有机酸及其衍生物可利用碳源6种,氨基酸及其衍生物类碳源6种。本研究将miRNA导入酵母中,发现miRNA可影响酵母的抗逆性,并可改变酵母的生理生化代谢特性。这说明miRNA在酵母体内是起作用的。就目前掌握的文献来看,这是首次有明确证据说明miRNA在最简单的真核生物中发挥功能。本研究将传统的基因转导结合碳源利用的流程化鉴定相结合,发现了一种快速研究miRNA功能的研究方法。这种方法可将miRNA的初步功能研究缩短到7-14天。借助这种方法,观察碳源利用情况,本研究初步推测在酵母中,jcu-miR56可能与脂质代谢调控有关。通过将jcu-miR56的前体序列导入拟南芥,以导入空载体的拟南芥作对照,发现该miRNA提高拟南芥抗旱性,可促进拟南芥种子在正常和干旱环境下快速萌发。结合生物信息学工具预测小桐子中jcu-miR56的靶基因之一是过氧化氢酶2编码基因,推测其可能原因是拟南芥中的过氧化氢酶编码基因也受该miRNA调控。